Summary

インビトロ転写される RNA ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する

Published: May 01, 2019
doi:

Summary

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼを使用してポックスウイルスに感染した細胞で mRNA 翻訳調節を研究するためのプロトコールを提示します。このアッセイは、5 ‘-非翻訳領域 (UTR) および 3 ‘-UTR を含む、mRNA のシス要素による翻訳調節を研究するために使用することができます。この方法を使用して、異なる翻訳開始モードを調べることもできます。

Abstract

ウイルス DNA 複製後に転写されるすべてのポックスウイルス mRNA は、5 ‘-UTR において進化的に保存された、非テンプレート 5 ‘-ポリ (A) リーダーを有する。ポックスウイルス感染時の mRNA 翻訳における 5 ‘ ポリ (A) リーダーの役割を分析するために、in vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイを開発しました。このレポーターアッセイは、4つのコアステップで構成されています:(1) PCR 法転写のための DNA テンプレートを増幅します。(2) T7 RNA ポリメラーゼを用いて mRNA を生成する in vitro 転写;(3) インビトロで転写した mRNA を細胞内に導入するトランスフェクション。(4) 翻訳の指標としてのルシフェラーゼ活性の検出ここで説明した RNA ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイは、ポックスウイルス感染細胞におけるプラスミド複製の問題と、プラスミドからの不可解な転写を回避します。このプロトコルは、ポックスウイルス感染細胞以外の系で 5 ‘-UTR および 3 ‘-UTR を含む mRNA 中のシス要素による翻訳調節を決定するために用いることができる。さらに、この方法を使用して、キャップ依存性、キャップ非依存、再開始、および内部開始などのさまざまな変換開始モードを調べることができます。

Introduction

セントラルドグマによると、遺伝情報は DNA から RNA へ、そして最終的にタンパク質1,2に流れます。この遺伝情報の流れは、mRNA 翻訳3,4を含む多くのレベルで高度に調節されている。遺伝子発現の調節を測定するレポーターアッセイの開発は、このプロセスに関与する規制メカニズムの理解を容易にします。ここでは、ポックスウイルスに感染した細胞において、in vitro 転写 RNA ベースのルシフェラーゼを用いた mRNA 翻訳を研究するためのプロトコールについて述べる。

ポックスウイルスは、多くの非常に危険なヒトおよび動物病原体5を含む。他のすべてのウイルスと同様に、ポックスウイルスはタンパク質合成678のための宿主細胞機械に独占的に依存しています。ウイルスは、ウイルスタンパク質を効率的に合成するために、ウイルス mRNAs7,8の翻訳にリダイレクトするために細胞翻訳機械をハイジャックする多くの戦略を進化させました。ウイルスによって一般的に採用されているメカニズムの1つは、 cisの作用する要素をトランスクリプトに使用することです。顕著な例には、内部リボソーム進入部位 (IRES) およびキャップ非依存性翻訳促進剤 (引用)91011が含まれる。これらのシス元素は、ウイルス転写物を多様なメカニズム12,13,14を介して翻訳機械を誘致することによって翻訳優位にレンダリングする。100以上のポックスウイルス mRNAs は、5 ‘-非翻訳領域 (5 ‘-UTR) において進化的に保存されたシス作用素子を有する: これらの mRNAs15,16の非常に 5 ‘ 末端の 5 ‘-ポリ (a) リーダー。これらの 5 ‘-ポリ (A) リーダーの長さは不均一であり、転写17,18の間にポックスウイルスで符号化された RNA ポリメラーゼの滑りによって生成される。我々、および他の人は、最近、5 ‘-ポリ (A) リーダーがワクシニアウイルス (VACV) に感染した細胞の mRNA に翻訳優位を与えることを発見し、ポックスウイルス19,20のプロトタイプメンバーである。

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイは、ポックスウイルス感染19,21の間の mRNA 翻訳における 5 ‘-ポリ (A) リーダーの役割を理解するために最初に発達しました。プラスミド DNA 系ルシフェラーゼのレポーターアッセイは広く使用されていますが、ポックスウイルスに感染した細胞では結果の解釈が複雑になる欠点がいくつかあります。まず、プラスミドは、VACV 感染細胞22で複製することができる。第2に、不可解な転写は、しばしばプラスミド DNA182324から生じる。第3に、VACV プロモーター駆動転写は、不均一な長さのポリ (A) −リーダーを生成し、その結果、いくつかの実験18においてポリ (a) −リーダーの長さを制御することを困難にする。インビトロ転写された RNA ベースのルシフェラーゼは、これらの問題を回避し、データの解釈は簡単です。

この方法には、(1) ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の4つの主要なステップがあり、in vitro 転写のための DNA テンプレートを生成します。(2) mRNA を生成するインビトロ転写;(3) 細胞内に mRNA を送達するトランスフェクションおよび (4) 変換の指標としてのルシフェラーゼ活性の検出 (図 1)。得られた PCR アンプリコンは、5 ‘ 〜 3 ‘ 方向に以下の元素を含有する: T7 プロモーター、ポリ (A) リーダー、または所望の 5 ‘-UTR 配列は、ホタルルシフェラーゼオープンリーディングフレーム (ORF) に続いて、ポリ (A) テールを有する。PCR アンプリコンは、T7 ポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって mRNA を合成する鋳型として使用される。In vitro 転写の間、m7G キャップまたは他のキャップアナログは、新たに合成された mRNA に組み込まれる。証明された転写物は未感染または VACV 感染細胞にトランスフェクトします。.細胞溶解物をトランスフェクション後の所望の時間に収集し、トランスフェクトされた mRNA からのタンパク質産生を示すルシフェラーゼ活性を測定します。このレポーターアッセイは、5 ‘-UTR、3 ‘-UTR、またはその他の mRNA の領域に存在するシス要素による翻訳調節を研究するために使用することができます。さらに、in vitro 転写された RNA ベースのアッセイは、キャップ依存性の開始、キャップ非依存の開始、再開始および IRES のような内部開始を含む翻訳開始の異なるメカニズムを研究するために使用することができる。

Protocol

1. PCR による In Vitro転写用 DNA テンプレートの作成 PCR によって DNA テンプレートを調製するために、設計プライマー。プライマーの設計に際しては、プライマー長、アニーリング温度 (Tm)、GC 含有量、G や C などの 3 ‘ 末端などの重要な特性を考慮してください。注:これらの文献25、26、<sup class="xref…

Representative Results

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼの4つのステップは、レポーターアッセイ: in vitro 転写のための DNA テンプレートを生成するために、インビトロで、mRNA を生成する転写、mRNA トランスフェクション、およびルシフェラーゼ測定、スケマティックダイアグラムで見ることができます (図 1)。DNA テンプレート (Fluc および Rluc) の両方のた…

Discussion

全ての4コアステップは、in vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイの成功にとって重要である。プライマーの設計、特に T7 プロモーター配列には特別な注意が払われるべきである。T7 RNA ポリメラーゼは、5 ‘-UTR 配列の前に追加された T7 プロモーターにおいて下線が付いた最初の G (gGG-5′-UTR-AUG-) からの転写を開始する。転写開始部位 (TSS) は、5 ‘ 末端で最初の G ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクトは、国立衛生研究所 (AI128406 www.nih.gov) が ZY に、また一部はジョンソンがん研究センター (http://cancer.k-state.edu) によって、大学院生の夏期給付の形で PD に資金を提供されました。

Materials

2X-Q5 Master mix New England Biolabs M0492 High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs S1411L Anti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate Corning 3693 Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1960 Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit OMEGA BIO-TEK D6492 PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate Luminometer Promega GM2010 Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit New England Biolabs E2050S In-Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019 Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000 Thermo Fisher Scientific ND-2000 Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985070 Reduced serum media
Purelink RNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific 12183018A RNA purification kit
Vaccinia Capping System New England Biolabs M2080 Capping system

References

  1. Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
  2. Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
  3. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
  4. Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
  5. Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
  6. Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
  7. Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
  8. Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
  9. Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
  10. Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
  11. Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
  12. Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
  13. Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
  14. Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
  15. Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
  16. Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
  17. Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
  18. Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
  19. Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
  20. Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
  21. Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
  22. De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
  23. Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
  24. Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
  25. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  26. Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
  27. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
  28. Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
  29. Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
  30. Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
  31. Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
  32. Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
  33. Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
  34. Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
  35. Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).

Play Video

Cite This Article
Dhungel, P., Cantu, F., Hernandez, C., Yang, Z. In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells. J. Vis. Exp. (147), e59626, doi:10.3791/59626 (2019).

View Video