Este protocolo ilustra um método de encapsulamento da pilha pela gelação física rápida do alginato para imobilizar pilhas. Os microgrânulos obtidos permitem a secreção controlada e sustentada de amiloide-β ao longo do tempo e podem ser usados para estudar os efeitos do amilóide-β secretado em modelos in vitro e in vivo.
De acordo com a hipótese da cascata do amilóide, o disparador o mais adiantado no desenvolvimento da doença de Alzheimer (AD) é a acumulação de fragmentos tóxicos do amilóide-β (aβ), conduzindo eventualmente às características clássicas da doença: chapas do amilóide, emaranhados neurofibrilary e perda sináptica e neuronal. A falta de modelos pré-clínicos não transgênicos relevantes refletivos da progressão da doença é um dos principais fatores que dificultam a descoberta de tratamentos medicamentoso efetivos. Para este fim, nós desenvolvemos um protocolo para a fabricação de microesferas do alginato que contem pilhas amyloid-secreting úteis para o estudo dos efeitos da produção crônica de aβ.
Células de ovário de hamster chinês previamente transfectadas com um gene APP humano, secretando aβ (i.e., células 7PA2), foram utilizadas neste estudo. Um modelo in vitro tridimensional (3D) para a liberação sustentada de aβ foi fabricado por encapsulamento de células 7PA2 em alginato. O processo foi otimizado para atingir um diâmetro de grânulo de 500-600 μm para estudos in vivo mais adicionais. A otimização do encapsulamento de células 7PA2 em alginato foi realizada alterando parâmetros de fabricação, por exemplo, concentração de alginato, vazão de gel, potencial eletrostático, frequência de vibração da cabeça, solução de gelivamento. Os níveis de aβ secretado foram analisados ao longo do tempo e comparados entre os grânulos de alginato e os métodos de cultura celular padrão (até 96 h).
Uma concentração de 1,5 x 106 7pa2 Cells/ml e uma concentração do alginato de 2% (w/v) tamponado com HEPES e a gelação subseqüente no cloreto de cálcio de 0,5 M por 5 minutos foram encontrados para fabricar os microbeads os mais estáveis. Os microgrânulos fabricados foram 1) de tamanho uniforme, 2) com um diâmetro médio de 550 μm, 3) contendo cerca de 100-150 células por microgrânulo e 4) capazes de secretar aβ.
Em conclusão, nosso método otimizado para a produção de microesferas estáveis de alginato contendo células 7PA2 produtoras de amiloides pode possibilitar a modelagem de aspectos importantes da AD, tanto in vitro como in vivo.
Modelar a doença neurodegenerativa é desafiador devido à natureza complexa e intrincada do cérebro. Na doença de Alzheimer (AD), acredita-se que a perda progressiva da função sináptica e morte dos neurônios seja um efeito a jusante da superprodução sustentada e acúmulo de peptídeos beta amilóide (aβ) após o processamento anormal do precursor amiloide proteína (app) de acordo com a hipótese da cascata do amilóide1.
A fim compreender os mecanismos desta patologia amyloid-induzida e ajudar na identificação de alvos novos do tratamento, os cientistas desenvolveram vários modelos in vivo pré-clínicos. Uma categoria de modelos utiliza uma injeção do bolus de um peptide sintético do aβ no cérebro2,3,4do rato. A principal limitação de tais modelos é que eles dependem de um único ponto ou tratamentos repetidos com peptídeos aβ em altas concentrações depositadas de uma só vez. Isso é incompatível com a natureza crônica e sustentada da liberação de aβ na doença5. Outra categoria de modelos in vivo é modelos animais transgênicos expressando uma ou mais mutações genéticas ligadas às variações familiares dadoença6,7, 8,9, 10. no entanto, uma vez que a AD familiar só responde por menos de 5% de todos os casos de Alzheimer11, a relevância destes modelos na tradução para a AD esporádica em seres humanos é questionável12. Outra desvantagem da abordagem transgênica é a formação acelerada de aβ desde o nascimento, que se traduz em déficits na função cognitiva e alterações patológicas de forma muito rápida e agressiva para se assemelhar à progressão da doença em AD esporádico em pacientes12 . Por exemplo, o modelo 5x FAD produz chapas em tão pouco quanto 1,5 meses13.
Curiosamente, ambas as categorias resultam em mudanças na função cognitiva de relevância para a pesquisa de anúncios2,3,4,5,6, e às vezes eles são acompanhados pelo aparecimento de características patológicas da doença, tais como placas amilóides6,8, fosforilação Tau6,7 e/ou perda sináptica e neuronal7,9, a 14. Mas enquanto esses tipos de modelos podem nos dar uma visão sobre os efeitos de altos níveis de amiloide no cérebro, que são freqüentemente associados com estágios posteriores da AD, eles não refletem as alterações anteriores expostas em resposta à exposição crônica e sustentada ao aβ peptídeo12, como expressão alterada de marcadores sinápticos15 e componentes na matriz extracelular16. Portanto, ainda resta a necessidade de criar um modelo crônico que ilustra com mais precisão os efeitos da secreção sustentada de aβ na cognição in vivo e ilustra as mudanças na patologia.
Para este fim, nós desenvolvemos um sistema que permita a secreção constante, sustentada de aβ em uma maneira controlada imobilizando pilhas amyloid-secreting dentro dos microbeads do hidrogel, que podem subseqüentemente ser implantados dentro do cérebro adulto do rato para modelar aspectos de AD esporádico.
O alginato foi o biomaterial selecionado por ser biocompatível e não induz nenhuma resposta adversa quando implantado in vivo17. A encapsulação de células em hidrogéis de alginato tem sido bem estabelecida nas últimas quatro décadas. O primeiro exemplo de sua tradução para a clínica foi relatado para o tratamento do diabetes mellitus tipo 117. O relatório o mais adiantado do encapsulamento bem sucedido das ilhotas de Langerhans remonta a 1980. A transplantação de microesferas que contem pilhas decontenção revolucionou opções do tratamento para pacientes do diabético como restaurou a função pancreatic, eliminando a necessidade para a terapia da injeção do insulin18. Estes trabalhos relatam em como o encapsulamento da pilha pode protegê-los das tensões externas, se mecânico ou químico. De facto, os grânulos do alginato actuam como uma barreira e isolam pilhas do ambiente circunvizinho que preservam seu phenotype, enquanto permitindo o acesso suficiente aos meios circunvizinhos para nutrientes e afastamento de subprodutos celulares19. Além disso, o uso de alginato permite a correspondência de propriedades mecânicas do tecido mole20. Os hidrogéis de alginato podem ser ajustados para ter uma rigidez de 1-30 kPa, simplesmente variando a concentração de alginato e a densidade de cross-linking20,21. Este é um aspecto essencial, não só para manter a expressão fenotípica de células encapsuladas in vitro, mas também para evitar quaisquer efeitos inflamatórios após o Engraftment in vivo22.
Neste protocolo, as células 7pa2-uma linha de células de ovário de hamster chinês que é estavelmente transfected com um humano app V717F mutado gene23 -são usados. Estas células produzem continuamente produtos catalíticos de aplicação, incluindo aβ1-4224,25, e têm sido utilizados para gerar aβ como uma alternativa à produção sintética em estudos pré-clínicos, agudos in vivo26. Nós descrevemos um método da fabricação para imobilizar as pilhas 7PA2 dentro dos microbeads do alginato do ‘ macio ‘, projetados permitir a secreção sustentada das biomoléculas. Como uma prova de conceito, nós relatamos na liberação do peptídeo aβ1-42 ao longo do tempo. O alginato que é usado é um alginato de baixa viscosidade com um peso molecular de 120.000-190000 g/mol e uma relação mannuronic a oligo de 1,56 (M/g).
Em uns estudos mais adicionais, estes microesferas podem com segurança ser transplantados dentro das regiões do cérebro do rato da relevância a AD (por exemplo, o Hippocampus) para estudar os efeitos da secreção crônica de aβ no comportamento in vivo e na patologia ex vivo. Além disso, este sistema pode ser usado para estudar os efeitos da liberação crônica de aβ em aplicações in vitro e ex vivo. Por exemplo, os microgrânulos de alginato contendo 7PA2 podem ser cocultivados in vitro com culturas neuronais ou astrocíticas para avaliar os efeitos da exposição crônica aβ em mecanismos celulares associados à AD. Além disso, este método pode ser usado para examinar a relação entre a produção crônica de Aβ e a potenciação a longo prazo na eletrofisiologia ex vivo.
O destaque deste protocolo é a modularidade e flexibilidade do método de fabricação, o que possibilita a fabricação de grânulos de alginato com uma dimensão alvo por parâmetros de fabricação de ajuste fino. Dependendo da aplicação, o protocolo pode ser ajustado para obter alvos medida com relação ao tamanho do microgrânulo, densidade das células encapsuladas e rigidez de microesferas. Este protocolo pode ser usado para o encapsulamento de uma variedade de tipos de células, desenvolvendo modelos tridimensionais (3D) in vitro mais relevantes para estudar patologias diferentes. Nós relatado recentemente em como as pilhas alginato-encapsuladas podem ser usadas para modelar estágios adiantados da progressão20do cancro.
O conceito do processo do encapsulamento é baseado na extrusão de um jato laminar das pilhas suspendidas na solução do alginato através de um bocal. Uma cabeça vibratória interrompe o jato com uma frequência controlada, resultando em gotículas baseadas em alginato de tamanho igual. Um campo elétrico externo permite a separação das gotas formadas com base em alginato, que, ao entrar em contato com uma solução enriquecida em íons divalentes, como íons cálcio, pode rapidamente cruzar a ligação, preservando sua forma esférica. A incubação na solução de gelação permite a formação de microesferas esféricas contendo células dentro de um hidrogel físico homogêneo27. O tamanho do alvo de microesferas e de hidrogéis do alginato permite a troca nutriente dos e do oxigênio com meios da cultura da pilha por longos períodos de tempo (semanas). Figura 1 A mostrar uma representação esquemática do aparelho de encapsulamento utilizado (Figura 1B).
Figura 1 : O sistema de encapsulamento. (A) representação esquemática do sistema de encapsulamento. Uma suspensão de célula alginato é carregada em uma seringa (2) e alimentada através de um reservatório em uma velocidade de extrusão definida na bomba da seringa (1). No reservatório, um chapéu de vibração (3) vibra em uma frequência definida por um gerador de forma de onda (4) para interromper o fluxo em intervalos iguais, formando gotículas de tamanho igual. Como a solução é alimentada através de um bocal (5) e as gotas são formadas, um potencial eletrostático é aplicado através de um eletrodo (7) definido por um gerador de tensão (6), que carrega levemente a superfície das gotas, permitindo que o fluxo se espalhe como resultado de repelir forças eletrostáticas. Como as gotas se envolvem com o banho de gelação (8), CA2 +-cross-linking conduzido de alginato resulta na formação de microesferas esféricas. (B) fotografia do encapsulator antes da fabricação de microgrânulos do alginato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O tamanho do microbead pode ser alterado dependendo do uso pretendido. A fim controlar o tamanho do microbead, os vários parâmetros esboçados em Figura 1a e no protocolo são ajustados conformemente. O diâmetro interno do bocal usado tem um impacto substancial no tamanho das gotas; mais parâmetros de encapsulamento de ajuste, ou seja, velocidade de extrusão, freqüência de vibração e tensão, é fundamental para alcançar uma distribuição de tamanho consistente. Tabela 1 esboça como os parâmetros diferentes podem alterar o tamanho dos microesferas conseguidos com este sistema.
Parâmetro | Tamanho do bocal | Freqüência da vibração | Vazão | Tensão do elétrodo |
Tamanho do grânulo | – |
Tabela 1: Parâmetros da fabricação e sua influência no tamanho do microbead. A tabela ilustra como cada parâmetro pode influenciar o tamanho resultante de microbeads fabricados, independentemente do bico e da viscosidade da solução utilizada.
O método descrito neste artigo é útil para encapsuar células atingindo uma distribuição de tamanho estreito de microesferas de alginato27. Ele também oferece a vantagem de células crescentes em um ambiente imuno-isolado17,18, protegendo-os do stress externo. Adicionalmente, a encapsulação de células em alginato mais estreitamente imita as condições fisiológicas, especificamente no que diz respeito às interações célula-célula e rigidez da matriz20. Estes fatores são todos particularmente cruciais para o uso subseqüente em aplicações relevantes, tais como o Engraftment in vivo, impedindo reações imunes potenciais no tecido circunvizinho17. Além disso, uma grande vantagem deste protocolo é a fácil tuneability de acordo com a aplicação de interesse: é possível modificar o protocolo e otimizar os parâmetros para a fabricação de grânulos maiores ou menores, e mais macios ou mais duros. O método descrito é usado para fabricar grânulos pequenos o suficiente para serem injetados com métodos minimamente invasivos, e suficientemente grandes o suficiente para sediar um número de células e fornecer uma liberação suficiente de aβ para resultar em efeitos comportamentais e patológicos observáveis após a injecção em modelos animais.
O sucesso deste protocolo é dependente de um número de etapas críticas. A manipulação de pilha cuidadosa e as técnicas óptimas da cultura da pilha são importantes manter a viabilidade e a função da pilha20,28. Usar condições padrão da cultura assegura a conservação da função normal de 7PA2 pilhas, como observado. Isso permite que um perfil de liberação semelhante para aβ1-42 de células encapsuladas quando comparado com culturas 2D. Além disso, para que o protocolo funcione de forma otimizada, uma solução de alginato de baixa viscosidade garante melhores resultados em comparação com uma solução de alginato de alta viscosidade. Isto assegura-se de que um jato laminar homogêneo seja expulso através do bocal e de uma distribuição uniforme das pilhas dentro da matriz dos grânulos fabricados27. Os materiais usados para encapsular as células devem ter um mecanismo de gelação muito rápido, permitindo a retenção da forma.
Outro passo crítico neste protocolo é o manuseio de microgrânulos fabricados após a gelação. Aqui, nós mostramos a recuperação de microesferas usando uma pipeta plástica da grande abertura para transferir os grânulos. Alternativamente, derramar a solução do cloreto de cálcio que contem os microesferas em um filtro da malha pode ser usado para a recuperação do grânulo. Uma pipeta sorológicos grande (5, 10 ou 25 ml) pode ser usada para elaborar os microesferas e lavado então através do filtro da malha em vez do derramamento. A vantagem deste é uma confiança mais elevada na esterilidade do procedimento comparado a derramar. No entanto, das limitações é que alguns grânulos podem ser distorcidos se eles são compactados pela pipeta, além de arriscar um rendimento mais baixo se uma grande proporção de microesferas não são resgatados.
Esta abordagem tem sido usada para encapsular diferentes linhagens celulares para modelar e estudar diferentes doenças (por exemplo, liberação de insulina de Illet pancreático encapsulado). A novidade de nossa aproximação é o Engraftment dos microesferas gerados usando este protocolo como um método útil em modelar aspectos importantes da doença de Alzheimer in vivo. Ao comparar o perfil de liberação de aβ de células encapsuladas (Figura 4) aos níveis de aβ gerados por uma injeção de bóus (como o relatado em outros estudos3,26), uma liberação mais crônica e sustentada de aβ pode ser Esperado. A Figura 6 ilustra a tendência prevista que pode ser alcançada. Usar este sistema para a modelagem in vivo é mais relevante para a forma como a doença progride e pode ser mais útil na descoberta e desenvolvimento de fármacos.
Figura 6 : Perfil de libertação previsto de aβ1-42 a partir de células 7pa2 encapsuladas em comparação com uma injecção em bóus. O perfil da liberação de aβ dos microesferas enxertado 7pa2-contendo permite o teste dos efeitos do aβ crônico e sustentado em um modelo animal da relevância a AD. Inversamente, uma injeção do bolus criaria um ponto em níveis de aβ durante um curto período de tempo, seguido por uma liberação rápida de aβ do cérebro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer ao senhor deputado Kajen Suresparan, ao Dr. Jonathan Wubetu, ao senhor deputado Dominik Grudzinski, à senhora Chen Zhao e ao Dr. Thierry Pilot a sua ajuda na optimização da fabricação de microesferas de alginato, da cultura celular e da deteção de aβ, e de Discussões.
µManager software | Vale Lab, UCSF, USA | v.1.46 | |
0.22 um PES filter | Merck, UK | SLGP033RS | |
15mm Netwell insert 74 um mesh filter | Constar, usa | #3477 | |
Alginic acid sodium salt from brown algae | Sigma-Aldrich,uk | A0682 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich,uk | C1016 | |
CellTiter96 AQueous One Solution cell proliferation assay | Promega, USA | G3580 | |
Encapsulator | Inotech | IE-50 | serial no. 05.002.01-2005 |
HEPES | Sigma-Aldrich,uk | H4024 | |
Hu Aβ 1-42 ELISA | ThermoFisher, UK | KHB3441 | |
ImageJ software | ImageJ | v1.49p | |
Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | |
Leica microscope | Leica microsystems, UK | DMI6000B | |
Neo sCMOS Camera | Ander, UK | 5.5 | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,uk | D1408 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich,uk | 433209 | |
Trispdium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich,uk | W302600-K | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich,uk | T4049 |