Summary

Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen

Published: May 27, 2019
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Summary

Hier werden Protokolle zur Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und zur Isolierung ihrer Exoproteome beschrieben. Beide Verfahren verkörpern wichtige Schritte zur Gewinnung von Polymeren oder Proteinen mit hohen Reinheitsgraden, die für weitere Analysen oder Anwendungen verwendet werden können. Sie können auch einfach an die spezifischen Benutzerbedürfnisse angepasst werden.

Abstract

Cyanobakterien können aktiv eine Breite von Biomolekülen in die extrazelluläre Umgebung absondern, wie Heteropolysaccharide und Proteine. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Biomoleküle kann das Wissen über ihre Sekretionswege verbessern und helfen, sie zu manipulieren. Darüber hinaus sind einige dieser Biomoleküle auch im Hinblick auf biotechnologische Anwendungen interessant. Hier sind zwei Protokolle für eine einfache und schnelle Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen beschrieben. Das Verfahren zur Isolierung freigesetzter Kohlenhydratpolymere basiert auf konventionellen Fällungstechniken von Polysacchariden in wässrigen Lösungen mit organischen Lösungsmitteln. Dieses Verfahren bewahrt die Eigenschaften des Polymers und vermeidet gleichzeitig das Vorhandensein von Verunreinigungen aus Zellablagerungen und Kulturmedium. Am Ende des Prozesses ist das lyophilisierte Polymer einsatzbereit oder charakterisiert oder kann je nach Endverwendung weiteren Reinigungsrunden unterzogen werden. In Bezug auf die Isolierung des cyanobakteriellen Exproteoms basiert die Technik auf der Konzentration des zellfreien Mediums nach Entfernung der Hauptverunreinigungen durch Zentrifugation und Filtration. Diese Strategie ermöglicht eine zuverlässige Isolierung von Proteinen, die über Membrantransporter oder äußere Membranbläschen ins extrazelluläre Milieu gelangen. Diese Proteine können anschließend mit Standard-Massenspektrometrie-Techniken identifiziert werden. Die hier vorgestellten Protokolle können nicht nur auf eine breite Palette von Cyanobakterien angewendet werden, sondern auch auf andere Bakterienstämme. Darüber hinaus können diese Verfahren leicht auf die endgültige Verwendung der Produkte, den erforderlichen Reinheitsgrad und die Bakterienstämme zugeschnitten werden.

Introduction

Cyanobakterien sind weithin als produktive Quellen von Naturprodukten mit vielversprechenden biotechnologischen/biomedizinischen Anwendungen anerkannt. Daher sind das Verständnis von cyanobakteriellen Sekretionsmechanismen und die Optimierung der Extraktions-/Wiederherstellungsmethoden unerlässlich, um Cyanobakterien als effiziente mikrobielle Zellfabriken zu implementieren.

Viele cyanobakterielle Stämme sind in der Lage, extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) herzustellen, die hauptsächlich durch Heteropolysaccharide gebildet werden, die mit der Zelloberfläche assoziiert bleiben oder in das Medium1freigesetzt werden. Diese freigesetzten Kohlenhydratpolymere haben im Vergleich zu anderen Bakterien deutliche Eigenschaften, die sie für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. antivirale Mittel2, immunstimulierend3, Antioxidans4, Metall-Chelatierung5, emulgierend6, und Drogen-Liefermittel7,8). Die Methodik zur Isolierung dieser Polymere trägt nicht nur zu einer verbesserten Ausbeute bei, sondern auch zu erhöhter Reinheit und den spezifischen physikalischen Eigenschaften des erhaltenen Polymers9. Ein Großteil dieser Verfahren zur Isolierung der Polymere stützt sich auf Niederschlagsstrategien aus dem Kulturmedium, die aufgrund der starken anionischen Natur des Polymers leicht zu erreichen sind9,10. Darüber hinaus kann die Entfernung der im Niederschlagsschritt verwendeten Lösungsmittel durch Verdunstung und/oder Lyophilisierung schnell erreicht werden. Je nach vorgesehener Anwendung können verschiedene Schritte nach oder vor der Polymerfällung gekoppelt werden, um das Endprodukt zuzuschneiden, einschließlich Trichloressigsäure (TCA) Behandlung, Filtration oder Größenausschlusschromatographie (SEC) Säulenreinigung10.

Cyanobakterien sind auch in der Lage, eine breite Palette von Proteinen durch Wege abhängig von Membrantransportern (klassisch)11 oder vermittelt durch Vesikel (nicht-klassische)12zu sezernieren. Daher stellt die Analyse des cyanobakteriellen Exproteoms ein wesentliches Werkzeug dar, um sowohl cyanobakterielle Proteinsekretionsmechanismen zu verstehen/manipulieren als auch die spezifische extrazelluläre Funktion dieser Proteine zu verstehen. Zuverlässige Isolierung und Analyse von Exoproteomen erfordern die Konzentration des extrazellulären Milieus, da der Überfluss an abgesonderten Proteinen relativ gering ist. Darüber hinaus können andere physikalische oder chemische Schritte (z. B. Zentrifugation, Filtration oder Proteinfällung) die Qualität des erhaltenen Exoproteoms optimieren, den Proteingehalt13anreichern und das Vorhandensein von Verunreinigungen (z. B. Pigmente, Kohlenhydrate, etc.) 14 , 15 oder die Dominanz intrazellulärer Proteine in den Proben. Einige dieser Schritte können jedoch auch die Gruppe von Proteinen einschränken, die nachgewiesen werden können, was zu einer voreingenommenen Analyse führt.

Diese Arbeit beschreibt effiziente Protokolle zur Isolierung von freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Exoproteomen aus Cyanobakterien-Kulturmedien. Diese Protokolle können leicht an die spezifischen Ziele und Benutzerbedürfnisse der Studie angepasst werden, wobei die hier vorgestellten grundlegenden Schritte beibehalten werden.

Protocol

1. Cyanobacterial freigesetzte Kohlenhydrat-Polymer-Isolierung Polymerisolierung und Entfernung von Verunreinigungen Kultivieren Sie den cyanobakteriellen Stamm unter Standardbedingungen [z. B. 30 °C unter einem 12-h-Licht (50 ‘E m’2s ‘1)/12 h dunkles Regime, mit Orbitalschütteln bei 150 U/min]. Messen Sie das Wachstum mit Standardprotokollen [z.B. optische Dichte bei 730 nm (OD730nm), Chlorophyll a, Trockengewicht, etc.], und messen Sie da…

Representative Results

Eine schematische Darstellung des beschriebenen Verfahrens zur Extraktion freigesetzter Kohlenhydratpolymere aus cyanobakteriellen Kulturen ist in Abbildung 1dargestellt. Gefällte Polymere des moderaten EPS-Herstellers Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 und des effizienten EPS-Herstellers Cyanothece sp. CCY 0110 sind in Abbildung 2dargestellt. In Abbildung 3sind lyophilisierte Polymere mit unterschiedlichen…

Discussion

Um bakterielle Sekretionsmechanismen besser zu verstehen und die freigesetzten Produkte zu untersuchen, ist es von größter Bedeutung, die effiziente Isolierung und Analyse der Biomoleküle in der extrazellulären bakteriellen Umgebung (z. B. freigesetzte Kohlenhydratpolymere und Proteine).

Cyanobakterielle extrazelluläre Kohlenhydratpolymere sind extrem komplex, vor allem aufgrund der Anzahl und des Anteils verschiedener Monosaccharide, die ihre Zusammensetzung bilden1</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde aus Fondso Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) Mitteln über das COMPETE 2020 – Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal 2020, und aus portugiesischen Fonds über FCT – Fundaéo para a Ciéncia e finanziert. ein Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior im Rahmen des Projekts POCI-01-0145-FEDER-028779 und des Zuschusses SFRH/BD/99715/2014 (CF).

Materials

Dialysis membranes Medicell Membranes Ltd  DTV.12000.07 Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll 
Ethanol 96% AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. 4.000.02.02.00 Fermentation ethyl alcohol 96% AGA
PES Filter 0.2 μm Fisher Scientific, Lda 15206869 Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR 
Amicon Ultra-15, Ultracel-3K Merck Millipore Ltd. UFC900324 Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Fisher Scientific, Lda 10741395 Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration
Brillant Blue G Colloidal Concentrate  Sigma Aldrich Química SL B2025-1EA Coomassie blue 

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Cite This Article
Flores, C., Tamagnini, P. Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins. J. Vis. Exp. (147), e59590, doi:10.3791/59590 (2019).

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