Culturing ומדידת עוברי והיילוד מורנה עצמות ארוכות

צמיחת איברים צריך להיות מכוון הדוק כדי למנוע את המראה של הפרעות גדילה, וכרוך בוויסות של סוגי תאים מרובים, מסלולים מולקולריים ומוצלב בין חלקים שונים של הגוף. טכניקות הדמיה חיוניים כדי לטפל בשינויים המתרחשים במשך הזמן בעובר הולך וגדל, הן בתנאים נורמליים, כמו גם לאחר המושרה הנגרמת במערכת. עוברים עם התפתחות תוך רחמי, כגון מודלים מכרסם בשימוש נרחב, להציג אתגר נוסף עבור הדמיה חיה וטיפול בסמים, אשר ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש בטכניקות לשעבר התרבות הvivo. כדי ללכוד בהצלחה את התהליכים הvivo ולהשיג תוצאות משמעותיות, זה הופך להיות חיוני כדי למצוא את התנאים הנכונים culturing עבור כל איבר או רקמה.

רוב העצמות של השלד היונקים לגדול דרך endochondral האוסיפיקציה, שם הסחוס העובריים (מורכב של תאים המכונים כונדרוציטים) כוננים האורך והוא מוחלף בהדרגה על ידי עצם. תהליך זה קורה בלוחות צמיחה, הממוקם בסוף העצמות הארוכות, שבו שלושה אזורים ניתן להבחין: נח, מתרבים, ו יפרטרופית^1,2. ראשית, כונדרוציטים עגולות באזור מנוחה המעבר לתוך כונדרוציטים האופניים טורי באזור ההתרבות. בשלב הבא של בידול, כונדרוציטים אלה להפוך יפרטרופית ולהתחיל הפרשה סוג X קולגן. כונדרוציטים יפרטרופית לארגן את הצעדים הבאים של האוסיפיקציה: הם מפרישות מולקולות איתות מפתח, כגון גורם הצמיחה רקמת חיבור, עצם מורפולפרוטאין חלבונים ו קיפוד הודי, ולהפנות את המינרליזציה של המטריצה, לגייס כלי הדם לחלק המרכזי של העצם, ו, על אפופטוזיס, לאפשר אוסטאופתית (העצם להרכיב תאים) כדי לפלוש למטריקס כדי ליצור את מרכז האוסיפיקציה העיקרי^3,4. מטריקס מינרליזציה מקלה על חדירת כלי הדם שדרכו האוסטאופה מחליפים את הסחוס היורד בעזרת מטריצת עצם⁵. האוסטאופתי ביותר לפלוש מטריצה הסחוס מן perichondrium, שכבה סיבי העוטפת את הסחוס⁶. לחילופין, שיעור של כונדרוציטים יפרטרופית מסוגלים לשרוד ולשנות את היכולת לעבור מעבר לעצמות^7,8,9. האורך הסופי של העצם נובע הצמיחה המצטברת של הסחוס חולף, שיעור הצמיחה שלו בתורו תלוי במספר ובגודל של יפרטרופית כונדרוציטים, ואת ייצור המטריצה שלהם¹⁰. בנוסף, הוכח לאחרונה כי משך השלב האחרון של היפרפרס התואם לאורך הסופי של העצם¹¹. לכן, רגולציה הדוקה של התפשטות והבידול של תאים אלה נדרש כדי להבטיח גודל העצם הנכון.

למרות הידע הניכר שנרכש לאורך השנים על הארגון והפיתוח של לוחות הצמיחה, מרבית המסקנות הללו מבוססות על התבוננות בסעיפים היסטלוגיים קבועים. שימוש ברקמות מספק מידע רב ערך אודות תהליך זה, אך ניתן לרכבו עם חפצים טכניים, כך שהוא לא יכול לשמש תמיד באופן אמין להערכת שינויים מורפולוגיים או בגודל בין שלבים שונים. בנוסף, כמו צמיחת העצם הוא תהליך דינמי, התמונות דו מימדי סטטי (2D) מציעים תובנה מוגבלת לתוך התנועה של התאים בצלחת הצמיחה, בעוד הדמיה הזמן לשגות על רקמה חיה יכול להציע מידע חשוב על ההתנהגות של כונדרוציטים בצלחת הצמיחה.

כל המגבלות הללו ניתן לפתרון פוטנציאלי באמצעות תרביות עצם vivo לשעבר. בעוד שפרוטוקולי תרבות העצם פותחו לפני זמן מה, הם הוחלו על עצמות ארוכות של מורטין. רוב המחקרים משתמשים בעצמות האפרוח בשל היתרונות הטכניים המוצעים על-ידי דגם האפרוח^12,13. תרבויות אורגאוטימית (ממשק אוויר/נוזלים) הוחלו על מורים עובריים, שהיו מתוחזקים בתרבות במשך 10 ימים¹⁴. הכלים הגנטיים המתוחכמים הזמינים בעכבר להפוך את המודל הזה מאוד מושך לשמש לשעבר בתרבות העצם vivo. המחקרים שהשתמשו בעכברים כדי להסתכל על גדילה העצם עבד בעיקר עם עצמות המסרק¹⁵, כנראה בשל גודלם הקטן ומספרים גדולים יותר המתקבלים לעובר¹⁶. למרות שנחשב באופן מסורתי עצמות ארוכות, מטאטסי להיכנס הזדקנות (מאופיין התפשטות מופחתת אינוולוציה של צלחת הצמיחה¹⁷) מוקדם יותר מאשר עצמות ארוכות אחרות vivo, ולכן הצמיחה המתמשכת שלהם לשעבר vivo אינו ממש את התהליך הvivo. לצורך מאמר זה, נשתמש במונח עצמות ארוכות לעצמות מאזורי הגפיים האבובי והביניים. מספר מחקרים קודמים השתמשו בעצמות murine ארוך, כגון שוקה, בתרבויות vivo לשעבר נצפתה צמיחה משמעותית של הסחוס אבל מעט ההתקשות¹⁸. השתמשנו גם בתרבויות הבאליס לאחרונה, בעיקר כדי ללמוד כchondrocyte dynamics¹⁹. מחקרים אחרים השתמשו בראשי הירך מעכברים צעירים²⁰ או רק את החלק המרוחק של עצם הירך לתרבות²¹. כמה יצירות אחרונות יותר בהצלחה לשלב את התרבות הvivo ex של עצמות מלאות עם הדמיה זמן ההדמיה כדי לרכוש תלת מימדי (3d) סרטים של כונדרוציטים ברקמת העכבר חי^22,23. המחברים הצליחו להתבונן בעבר אירועים מבלי שיבחינו בסידור מחדש של כונדרוציטים לאזור מתרבים²³ בדוגמה טובה של היישום הפוטנציאלי של תרבות vivo ex העצם. החלופה, כלומר, ניתוח תמונות סטטיות, דורשת טכניקות עקיפות ומורכבות. זה היה לידי ביטוי על ידי מחקר שנערך לאחרונה הערכת החשיבות של שיבוטים transversally לצמיחת הסחוס, שם מעקב גנטי עם זנים רבים העכבר העיתונאי בשילוב עם מידול מתמטי שימשו²⁴. לכן, התרבות הvivo לשעבר עשוי לעזור להשיג תובנה תהליכים דינמיים בצורה מהירה וישירה יותר.

כאן, אנו מציגים שיטה לתרבות ארוכה של עצמות ממורין, אשר ניתן לשלב עם טיפולים מולקולריים שונים ו/או עם הדמיה בזמן ההדמיה החיה. פרוטוקול זה מתאים את השיטות המשמשות בדוחות קודמים^15,18,25, אך מטפל בנושאים נוספים ומתמקד בעצמות ארוכות כגון השוקה, במקום בעצמות המסרק. לבסוף, הוא חוקר את הפוטנציאל של שימוש מבחינה סטטיסטית השוואות לזווג חזק על ידי culturing עצמות שמאל וימין בנפרד בנוכחות של חומרים שונים.