Un modello in vitro per lo studio dell'aggregazione Tau utilizzando la trasduzione dei neuroni umani mediata da lentivirali
Summary
Questo protocollo descrive una procedura in cui le colture neuronali umane vengono trasmutate con costrutti lentivirali che codificano per i Tau umani. Le colture traslegate mostrano aggregati Tau e patologie associate.
Abstract
L’aggregazione aberrante della proteina tau è coinvolta patogenicamente in una serie di malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD). Anche se i modelli murini di tauopatia hanno fornito una preziosa risorsa per indagare sui meccanismi neurotossici del Tau aggregato, sta diventando sempre più evidente che, a causa delle differenze tra le specie nella neurofisiologia, il cervello del topo non è adatto per modellare la condizione umana. I progressi nei metodi di coltura cellulare hanno reso le colture neuronali umane accessibili per uso sperimentale in vitro e hanno aiutato nello sviluppo di neuroterapeutici. Tuttavia, nonostante l’adattamento delle colture cellulari neuronali umane, i modelli in vitro di tauopatia umana non sono ancora ampiamente disponibili. Questo protocollo descrive un modello cellulare di aggregazione Tau in cui i neuroni umani vengono trasborsi con vettori lentivirali-derivati che il codice per Tau mutata patogenicamente fusa a una proteina gialla fluorescente (YFP) reporter. Le colture trasmarcate producono aggregati Tau che si macchiano positivamente per la Tioflavina e mostrano marcatori di neurotossicità, come la diminuzione della lunghezza assonale e l’aumento del volume lisosomiale. Questa procedura può essere un modello utile e conveniente per studiare le tauopatie umane.
Introduction
L’aggregazione patologica della proteina Tau associata al microtubulo è una caratteristica determinante di molte malattie neurodegenerative, tra cui AD, demenza frontotemporale (FTD), malattia di pick e paralisi sopranucleare progressiva (PSP)1. In uno stato non malato, Tau si lega e stabilizza i filamenti di microtubuli in assoni neuronali2. Tuttavia, l’iperfosforilazione di Tau associata alla malattia favorisce l’aggregazione Tau, la dissociazione dai microtubuli e la tossicità neuronale3. Gli effetti tossici del Tau aggregato possono comportare l’attivazione aberrante dei recettori colinergici4 e glutamatergic5 con conseguente disregolazione del calcio intracellulare e, infine, morte cellulare. Nei modelli animali, la riduzione del cervello Tau migliora la patologia nei topi AD6 e nei modelli murini di trauma cranico lieve ripetitivo7.
Le prove di montaggio dimostrano che la struttura e l’affinità di legame del Tau derivato dal topo sono distinte dal Tau derivato dall’uomo e che il Tau del topo non è adatto per modellare le tauopatie umane8. Tuttavia, i modelli di tauopatia cellulare umana non sono ampiamente disponibili in commercio. L’obiettivo generale di questo lavoro è quello di descrivere un modello in vitro di aggregazione Tau in cui i neuroni umani sono trasverti con vettori lentivirali-derivati contenenti costrutti Tau umani mutanti9. L’aggregazione Tau che causa costrutti lentivirali codifica per il dominio di ripetizione Tau che harnoioso P301L e V337M mutazioni fuse con un reporter YFP (Tau-RDLM-YFP) mentre il controllo costruisce il codice per il dominio di ripetizione Tau (WT) di tipo selvaggio fuso con un reporter YFP (Tau-WT-YFP). Le colture neuronali trasite usando questo metodo esprimono circa nove volte più Tau rispetto alle colture non trasdette. Anche se la quantità di espressione Tau iperespressa è approssimativamente uguale tra le cellule di Tau-RDLM-YFP-e Tau-WT-YFP-trasate, solo i neuroni trasati con Tau-RDLM-YFP mostrano aggregati. Le colture con Tau-RDLM-YFP si macchiavano positivamente per la Tioflavina e mostrano riduzioni della lunghezza assonale e della densità sinaptica. Pertanto, questo modello cellulare può essere uno strumento utile per studiare l’aggregazione Tau in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive la generazione di un modello in vitro di tauopatia umana che esibisce gli aggregati di argento-macchia-positivi e i grovigli di neurofibrillari positivi alla Tioflavina (NFTs). Inoltre, le cellule trasdotte mostrano patologie indotta da Tau come difetti morfologici, ridotta sinaptogenesi e un aumento del volume lisosomiale. Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce un modello accessibile e conveniente di tauopatia neuronale, che può essere utilizzato per gli studi di screeni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero ringraziare il dottor Peter Davies all’Albert Einstein College of medicine per aver fornito gli anticorpi PHF-1 e CP13 e il dottor Marc Diamond all’Università del Texas, nel sud-ovest, per aver fornito i costrutti Tau. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell’Alzheimer ‘ s Association (NIRG-14-322164) a S.H.Y. e dall’Istituto della California per la medicina rigenerativa (TB1-01193) a R.P.
Materials
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
References
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