Tau Aggregation Lentiviral kullanarak eğitim için bir In vitro modeli-ınsan nöronların aracılı dönüştürücü
Summary
Bu protokol, insan nöronal kültürlerin mutant insan Tau için lentiviral yapıları ile dönüştürücü olduğu bir prosedür ayrıntıları. Traned kültürler Tau toplamları ve ilişkili patolojileri görüntüler.
Abstract
Protein Tau aberrant toplama patilik nörodejeneratif hastalıkların bir dizi dahil, Alzheimer hastalığı (AD) dahil olmak üzere. Tauopati fare modelleri toplanan Tau nörotoksisik mekanizmaları araştırmak için değerli bir kaynak sağladı rağmen, bu giderek belirgin hale geliyor, nörofizyolojide türler arası farklılıklar nedeniyle, fare beyni için uygun değildir insan durumunu modelleme. Hücre kültürü yöntemlerindeki gelişmeler insan nöronal kültürlerini deneysel kullanım için erişilebilir hale almış ve nörokemoterapi gelişiminde destekli olmuştur. Ancak, insan nöronal hücre kültürlerinin adaptasyon rağmen, insan tauopati in vitro modellerde henüz yaygın olarak mevcut değildir. Bu protokol, insan nöronların lentiviral türeyen vektörler ile transkif olduğu, patik olarak mutasyona uğramış Tau için kod olan, Sarı floresan proteini (YFP) muhabiri olan Tau toplama hücresel modelini açıklar. Dönüştürücü kültürler, Tiyoflavin ve neurotoksisite görüntüleme belirteçleri için pozitif leke Tau agrega üretmek, gibi azalan Akral uzunluğu ve artmış lizozomal hacim gibi. Bu prosedür, insan tauopathies okumak için yararlı ve ekonomik bir model olabilir.
Introduction
Microtubule ilişkili protein Tau patolojik toplama birçok nörodejeneratif hastalıkların tanımlama özelliğidir, ad dahil, Frontotemporal Demans (FTD), Pick hastalığı, ve Progressive supranucleer palsi (PSP)1. Hastalıklı olmayan bir durumda, Tau, nöronal akkıslar2‘ de microtubül filayonlarını bağlar ve stabilize eder. Ancak, Tau hastalığı ilişkili hiperfosforilasyon Tau toplama teşvik, microtubules ayrışma, ve nöronal toksisite3. Toplanan Tau toksik etkileri kolinerjik4 ve glutamaterjik reseptörlerin anormal aktivasyonu içerebilir5 hücre içi kalsiyum disregülasyon sonucu, ve sonunda, hücrenin ölümü. Hayvan modellerinde, beyin Tau azalma AD fareler6 ve tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarı fare modellerinde patolojisini geliştirir7.
Montaj kanıtların yapısı ve bağlama benzeşimi fare türevi Tau insan türetilen Tau farklıdır ve bu fare Tau insan tauopathies8modelleme için uygun olmadığını gösterir. Ancak, insan hücresi tauopati modelleri yaygın olarak satışa sunulmaz. Bu çalışmanın genel hedefi, insan nöronlarının mutant insan Tau yapıları içeren lentiviral türevi vektörler ile dönüştürücü olduğu Tau toplama bir in vitro modeli açıklamak için9. Tau toplama neden lentiviral yapıları, P301L ve V337M mutasyonlar bir YFP Reporter (Tau-WT-YFP) için kullanılan Wild-Type (WT) Tau tekrarlama etki alanı için kod yapıları sırasında erimiş Tau Yinele etki alanı için ek olarak bir rıld (Tau-rdlm-YFP). Nöronal kültürler bu yöntemi kullanarak transribe yaklaşık dokuz kat daha fazla Tau nondönüştürüclü kültürler daha. Tau-RDLM-YFP-ve Tau-WT-YFP-traned hücreler arasında aşırı ifade edilen Tau ifadesinin miktarı kabaca eşit olsa da, yalnızca Tau-RDLM-YFP görüntü toplamları ile dönüştürücüye gelen nöronlar. Kültürler Tau-rdlm-YFP ile traned, Tiyoflavin için pozitif leke ve akal uzunlukta ve sinaptik yoğunlukta görüntü indirimleri. Bu nedenle, bu hücresel model in vitro Tau toplama okumak için yararlı bir araç olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, gümüş-leke-pozitif agregalar ve thioflavin-pozitif neurofibriller Tangles (NFTs) sergiler insan tauopati bir in vitro model nesil açıklar. Dahası, dönüştürücü hücreler, morfolojik kusurları, azaltılmış synaptogenez ve artmış lizozomal hacmi gibi Tau kaynaklı patolojileri görüntüler. Bu protokolün ana avantajı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek, hem de Tau toksisitesi analizi için kullanılan nöronal tauopati erişilebilir ve uygun maliyetli bir model sağlar olma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Tau yapıları sağlamak için PHF-1 ve CP13 antikorları ve Teksas Üniversitesi, Southwestern, Dr Marc Diamond tedarik için Albert Einstein Koleji tıp Dr Peter Davies teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma S.H.Y. için Alzheimer Derneği (NIRG-14-322164) ve California Enstitüsü rejeneratif tıp (TB1-01193) gelen hibe tarafından desteklenen oldu PR
Materials
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
References
- Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).
- Gomez-Ramos, A., et al. Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein. European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).
- Warmus, B. A., et al. Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).
- DeVos, S. L., et al. Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo. Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).
- Cheng, J. S., et al. Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLOS ONE. 9 (12), e115765 (2014).
- Ando, K., et al. Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model. The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).
- Reilly, P., et al. Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation. Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).
- Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species. The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).
- Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLOS ONE. 6 (3), e17540 (2011).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Passaging human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e263 (2007).
- Lathuiliere, A., et al. Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects. Scientific Reports. 7 (1), 13556 (2017).
- Asai, H., et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).
