Induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck in Arabidopsis Thaliana durch LhGR-vermittelten Trans-Aktivierung

Eine große Einschränkung in der Biologie in die genomische Zeitalter ist, die spezifische Rolle der Kontext eines bestimmten Faktor oder genetische Störung zu entschlüsseln. Konstitutive genetische Störungen wie z. B. Verlust der Funktion und Gain-of-Function Ansätze erlauben oft nur Endpunktanalyse der lebenslangen Anpassungsprozesse, die Unterscheidung zwischen primären und sekundären Effekten zu verschleiern. Darüber hinaus können Kontext spezifische Funktionen maskiert oder verdünnt durch groß angelegte Effekte in entfernte Gewebe oder in anderen Phasen der Entwicklung. Darüber hinaus kann im Extremfall Letalität mechanistische Einsicht entgegen. Ideal, um diese Probleme zu umgehen, könnte man die Wirkung von akuten genetische Störung in einem bestimmten Kontext wie z. B. einem bestimmten Zelltyp in gewissem Sinne zeitaufgelösten analysieren. Um dies zu erreichen, sind genetische Werkzeuge für induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck erforderlich¹. Um eine Ressource für die schnelle Bewertung der räumlich-zeitliche Dynamik einer Reaktion auf einen bestimmten Effektor zu bieten, haben wir kombiniert die Leichtigkeit des Klonens zur Verfügung gestellt von GreenGate System² mit nachgewiesener Wirksamkeit der GR-LhG4 System^{3, 4,5,6}. Wir haben eine Reihe von Zeilen, die mit dem Ausdruck der Chimären Transkriptionsfaktor, die LhG4 an den Liganden-bindende Domäne der Ratte Kortikoid-Rezeptor (GR)⁷ unter der Kontrolle der gut-gekennzeichneten Zelle Typ spezifischen Promotoren⁸fusioniert erzeugt. Im ruhenden Bedingungen, bleibt der Transkriptionsfaktor außerhalb der Kern der cytosolischen HSP90 die GR-Domäne gebunden ist. Mit dem Zusatz von synthetischen Liganden Dexamethason (Dex) nukleare Translokation wird induziert und LhG4 vermitteln Transkription Expressionskassetten unter Kontrolle eines Promotors cognate synthetische pOp-Typ , z. B. ein mTurquoise2-reporter enthalten in den Treiber-Linien, die Ausdruck-Domäne nach Induktion zu visualisieren.  Die Treiber-Zeilen enthalten somit technisch auch eine Effektor-Kassette. Die Kreuzung aus einer Reihe von Treiber-Linien mit einer Linie, die somit eine Effektor-Kassette mit, beispielsweise ein Gen des Interesses unter Kontrolle des gleichen pOp-Art -Promotors tragen ermöglicht die schnelle Beurteilung der die akuten oder langfristige Folgen der Effektor Ausdruck in einer Vielzahl von Zelltypen.

Hier bieten wir ein Protokoll beschreibt die Verfahren notwendig, um die Treiber und Effektor Linien zu erzeugen und zeigen, wie Zelle Art Konkretisierung kann induziert und folgte im schießen Sprossapikalmeristem Meristem, die Wurzel Sprossapikalmeristem Meristem und das Kambium der Arabidopsis. Um die Fähigkeiten und die Spezifität dieses Ansatzes zu veranschaulichen, nutzen wir die bekannten Transkriptionsfaktor VND7 die Xylem-wie sekundäre Zelle Wand Verdickungen ectopically fahren kann⁹. Behandlung von F1 aus einer Kreuzung zwischen der pSCR^10,11 -Treiber und die pOp6:VND7 Effektor Linie führt zur Bildung von ektopische Xylem-wie Zellen in der Stärke-Hülle, die Stammzellen von Arabidopsis .

Um die Generation der großen DNA-Baugruppen erforderlich für den Bau von Fahrer und Effektor Ausdruck Plasmide zu erleichtern, haben wir die schnelle und effiziente GreenGate Klonen Methode²verwendet. GreenGate Klonen ist basierend auf Typ II S Restriktionsenzyme Eco31I oder seine Isoschizomer BsaI². Diese Enzyme schneiden ihre asymmetrischen Anerkennung Aufstellungsorte produzieren Überhänge mit unterschiedlicher Basenzusammensetzung nachgeschaltet. Durch den Einbau von Eco31I /Bsaich Beschränkung in Oligonukleotide und Zuteilung von bestimmten Überhang Sequenzen auf DNA-Elemente, modulare Klonen erzielt wird, erleichtert die Erzeugung großer Baugruppen. Im Rahmen GreenGate fallen DNA-Module in Kategorien A-F basiert auf Überhang-Sequenz, die als Adapter dienen und sind in dieser Reihenfolge montiert. Die Primer konzipiert, um Ihr gewünschtes Produkt verstärken sollte daher gemäß dem gewählten Modul² (Abbildung 1A). Wenn es eine interne Eco31I gibt /BsaI Seite und die Reihenfolge ist nicht kompatibel mit den GreenGate-Eintrag und Ziel-Modulen, können Sie fortfahren, ohne mutagenizing, aber mit geringerer Effizienz. Alternativ können Sie Site-verwiesene Mutagenese Eco31I entfernen /Bsaich Restriktionsschnittstellen kümmert sich nicht um Aminosäuren in Genprodukte zu ändern.