Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères
Summary
L’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est un outil puissant pour comprendre les mécanismes moléculaires de la régulation génique. Cependant, la méthode implique des difficultés dans l’obtention de la fragmentation de chromatine reproductible par tonte mécanique. Ici, nous fournissons un protocole amélioré pour un jeu d’enfant en utilisant la digestion enzymatique.
Abstract
Pour exprimer les phénotypes cellulaires dans les organismes, les cellules vivantes exécutent l’expression de gène en conséquence, et les programmes transcriptionnels jouent un rôle central dans l’expression de gène. La machinerie transcriptionnelle cellulaire et ses protéines de modification de chromatine coordonnent pour réguler la transcription. Pour analyser la régulation transcriptionnelle au niveau moléculaire, plusieurs méthodes expérimentales telles que le déplacement de mobilité électrophorétique, le report transitoire et l’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) sont disponibles. Nous décrivons un test modifié de ChIP en détail dans cet article en raison de ses avantages en montrant directement des modifications d’histone et des interactions entre des protéines et l’ADN dans les cellules. L’une des étapes clés d’un succès d’un jeu d’enfant est le cisaillement de la chromatine. Bien que la sonication soit couramment utilisée pour la chromatine de cisaillement, il est difficile d’identifier les conditions reproductibles. Au lieu de tonte de chromatine par sonication, nous avons utilisé la digestion enzymatique avec la nucléase micrococcique (MNase) pour obtenir des résultats plus reproductibles. Dans cet article, nous fournissons un protocole d’assay ChIP simple en utilisant MNase.
Introduction
L’expression génique dans les cellules de mammifères est étroitement et dynamiquement réglée, et la transcription est l’une des étapes clés. La transcription génique est principalement réglementée par des facteurs de transcription et des histones. Un facteur de transcription est une protéine qui se lie à des séquences d’ADN spécifiques et contrôle la transcription des gènes. Ces facteurs favorisent ou inhibent le recrutement de la polymérase II (PolII), qui initie la synthèse de l’ARNm à partir de l’ADN génomique comme modèle1. Les modifications d’histone telles que l’acétylation et la méthylation des résidus de queue d’histone affectent positivement et négativement la transcription de gène en changeant la structuredechromatine 2. Puisque les altérations de l’expression génique affectent le contexte cellulaire, il est essentiel d’examiner les mécanismes moléculaires par lesquels la transcription est réglementée.
À ce jour, plusieurs méthodes d’étude de la régulation de la transcription génétique sont disponibles. L’analyse de changement de mobilité électrophorétique (EMSA), également appelée analyse de changement de gel, est utilisée pour analyser une interaction protéine-ADN3. Un extrait nucléaire de cellules d’intérêt est incubé avec une sonde d’ADN étiquetée par isotope radioactif (par exemple, 32P) et électrophoresed sur un gel de polyacrylamide. Son autoradiogramme montre que le complexe ADN-protéine migre plus lentement que la sonde dans un gel. En présence d’un anticorps contre la protéine, le complexe ADN-protéine-anticorps migre dans un gel plus lentement que le complexe ADN-protéine. Cette bande superdécalée révèle une liaison spécifique entre l’ADN et la protéine. Cependant, l’EMSA détermine seulement une interaction ADN-protéine spécifique dans un système sans cellules, et par conséquent on ne sait pas si l’interaction contrôle la transcription dans les cellules vivantes. L’exemple de journaliste transitoire, communément appelé test de journaliste de luciferase, a été développé pour aborder la régulation d’expression de gène dans les cellules. Typiquement, une région génomique en amont d’un gène d’intérêt est insérée dans un plasmide de journaliste, transfectée transitoirement dans les cellules, et l’activité de journaliste est mesurée. Une variété de mutants de suppression permet l’identification des régions qui sont responsables de la régulation des gènes. Même si un test de journaliste est un outil utile pour identifier les facteurs de transcription et lier les séquences d’ADN contrôlant la transcription, cette méthode a un inconvénient majeur en ce qu’un plasmide journaliste est exempt de structure de chromatine et ne reflète pas «réel» machines de transcription. En outre, les modifications apportées aux modifications de l’histone ne peuvent pas être déterminées par le système.
Le développement de la méthode d’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) a été basé sur les rapports de Jackson et Chalkley que la fixation de « cellule entière » avec la structure préservée de chromatine de formaldéhyde4,5. Depuis lors, de nombreuses techniques connexes ont été développées et améliorées6. Dans les analyses ChIP, les cellules sont fixées avec du formaldéhyde pour relier l’ADN et les protéines. La chromatine est fragmentée puis immunoprécipitée avec des anticorps d’intérêt. Le complexe immunitaire est lavé, et l’ADN est purifié. L’amplification de PCR avec des amorces ciblées à une région particulière du génome indique l’occupation des protéines d’intérêt dans le génome.
Bien que ChIP soit un outil puissant pour identifier les interactions des protéines telles que les facteurs de transcription et les histones modifiées avec l’ADN, la méthode implique quelques difficultés, telles qu’une étape de fragmentation de chromatine, dans la pratique. Sonication a été largement utilisé pour la chromatine de cisaillement; cependant, il est difficile d’identifier les conditions reproductibles. Le traitement de nucléase micrococcique (MNase) est une méthode alternative pour le tonte de chromatine. MNase est une endo-exonucléase qui digère l’ADN et l’ARN à double brin, à brin unique, circulaire et linéaire. Il est relativement facile de déterminer les conditions, y compris les quantités de chromatine et d’enzyme, la température et le temps d’incubation, pour une fragmentation optimale de la chromatine. Nous avons modifié et simplifié les protocoles existants, et nous avons établi une méthode simple et reproductible. Cet article fournit le protocole pour un examen ChIP en utilisant MNase dans les cellules de mammifères.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que la sonication soit couramment utilisée pour obtenir la chromatine fragmentée, il est long et lourd d’identifier les conditions reproductibles. Dans ce protocole, nous avons utilisé la digestion MNase parce que la digestion enzymatique devrait être plus facile d’identifier les conditions reproductibles. Une brève étape de sonication après la digestion de MNase (voir étape 2.2) a été nécessaire pour casser la membrane cellulaire et pour libérer la chromatine digérée. Par conséquent, la puissance de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche est appuyée par les redevances de Genentech à la Ville de l’Espoir. Ce travail n’est pas soutenu en tout ou en partie par les National Institutes of Health.
Materials
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2X iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , (1992).
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
