Summary

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

Published: May 10, 2019
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Summary

L’immunoprecipitazioni della chromatina (ChIP) è un potente strumento per comprendere i meccanismi molecolari della regolazione genica. Tuttavia, il metodo comporta difficoltà nell’ottenere la frammentazione della cromatina riproducibile mediante tosatura meccanica. Qui, forniamo un protocollo migliorato per un saggio ChIP utilizzando la digestione ezimatica.

Abstract

Per esprimere i fenotipi cellulari negli organismi, le cellule viventi eseguono l’espressione genica di conseguenza e i programmi trascrizionali svolgono un ruolo centrale nell’espressione genica. Il macchinario trascrittorio cellulare e le sue proteine di modificazione della cromatina si coordinano per regolare la trascrizione. Per analizzare la regolazione trascrizionale a livello molecolare, sono disponibili diversi metodi sperimentali come lo spostamento della mobilità elettroforetica, i saggi di immunoprecipitazioni transitori e cromatina (ChIP). Descriviamo un saggio ChIP modificato in dettaglio in questo articolo a causa dei suoi vantaggi nel mostrare direttamente le modifiche degli istoni e le interazioni tra proteine e DNA nelle cellule. Uno dei passi chiave di un saggio ChIP di successo è la tosatura della cromatina. Anche se la sonicazione è comunemente usata per la tosatura della cromatina, è difficile identificare le condizioni riproducibili. Invece di tosare la cromatina mediante sonicazione, abbiamo utilizzato la digestione enzimatica con nucleasi micrococcica (MNase) per ottenere risultati più riproducibili. In questo articolo viene fornito un semplice protocollo ChIP assay usando MNase.

Introduction

L’espressione genica nelle cellule dei mammiferi è regolata in modo stretto e dinamico, e la trascrizione è uno dei passi chiave. La trascrizione genica è regolata principalmente da fattori di trascrizione e istoni. Un fattore di trascrizione è una proteina che si lega a specifiche sequenze di DNA e controlla la trascrizione genica. Questi fattori promuovono o inibiscono il reclutamento di RNA polimerasi II (PolII), che avvia la sintesi di mRNA dal DNA genomico come modello1. Le modifiche istonicome l’acetilazione e la metilazione dei residui della coda istone irto influenzano positivamente e negativamente la trascrizione genica cambiando la struttura della cromatina2. Poiché le alterazioni nell’espressione genica influenzano il contesto cellulare, è essenziale esaminare i meccanismi molecolari con cui la trascrizione è regolata.

Ad oggi, sono disponibili diversi metodi per studiare la regolazione della trascrizione genica. L’analisi elettroforetica della mobilità (EMSA), chiamata anche analisi del cambio di gel, viene utilizzato per analizzare un’interazione proteina-DNA3. Un estratto nucleare proveniente da cellule di interesse viene incubato con una sonda di DNA con etichettatura isotoma radioattiva (ad esempio, 32P) ed elettroforise su un gel poliacrilammide. Il suo autoradiogramma mostra che il complesso DNA-proteinmi migra più lentamente della sonda in un gel. In presenza di un anticorpo contro la proteina, il complesso DNA-protein-anticorpo migra in un gel più lentamente del complesso DNA-protein. Questa banda supershiftata rivela un legame specifico tra il DNA e la proteina. Tuttavia, EMSA determina solo una specifica interazione DNA-proteina in un sistema privo di cellule, e quindi rimane sconosciuto se l’interazione controlla la trascrizione nelle cellule viventi. Il saggio transitorio del reporter, comunemente chiamato luciferasi reporter assay, è stato sviluppato per affrontare la regolazione dell’espressione genica nelle cellule. Tipicamente, una regione genomica a monte di un gene di interesse viene inserita in un plasmide reporter, trascinata transitoriamente in cellule e viene misurata l’attività del reporter. Una varietà di mutanti delezione consente l’identificazione delle regioni che sono responsabili della regolazione genica. Anche se un saggio reporter è uno strumento utile per identificare i fattori di trascrizione e rilegare le sequenze di DNA che controllano la trascrizione, questo metodo ha un grave svantaggio in quanto un plasmide reporter è privo di struttura cromatica e non riflette “reale” macchinari per la trascrizione. Inoltre, le modifiche ai istoni non possono essere determinate dal sistema.

Lo sviluppo del metodo di immunoprecipitazioni della cromatina (ChIP) si è basato sui rapporti di Jackson e Chalkley che la fissazione “intera cellula” con formaldeide conservava la struttura della cromatina4,5. Da allora, molte tecniche correlate sono state sviluppate e migliorate6. Nei saggi ChIP, le cellule sono fissate con formaldeide per collegare in modo incrociato DNA e proteine. La cromatina viene frammentata e quindi immunoprecipitata con anticorpi di interesse. Il complesso immunitario viene lavato e il DNA viene purificato. L’amplificazione PCR con primer destinati a una particolare regione del genoma rivela l’occupazione di proteine di interesse nel genoma.

Anche se ChIP è un potente strumento per identificare le interazioni di proteine come fattori di trascrizione e istoni modificati con il DNA, il metodo comporta alcune difficoltà, come una fase di frammentazione della cromatina, in pratica. La Sonicazione è stata ampiamente utilizzata per la tosatura della cromatina; tuttavia, è ingombrante identificare le condizioni riproducibili. Il trattamento nucleale micrococcale (MNase) è un metodo alternativo per la tosatura della cromatina. MNase è un endo-exonuclease che digerisce DNA e RNA a doppio filamento, a filamento singolo, circolare e lineare. È relativamente facile determinare le condizioni, comprese le quantità di cromatina e enzima, temperatura e tempo di incubazione, per la frammentazione ottimale della cromatina. Abbiamo modificato e semplificato i protocolli esistenti e abbiamo stabilito un metodo semplice e riproducibile. Questo documento fornisce il protocollo per un saggio ChIP che utilizza MNase nelle cellule dei mammiferi.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti Soluzione di paraformaldeide (PFA) del 18,5%. Aggiungere 0,925 g di PFA, 4,8 mL di acqua (utilizzare acqua ultrapurificata per tutto il protocollo) e 35 L da 1 M KOH in un tubo di plastica conica da 50 mL. Chiudere il tappo e riscaldare il tubo in un becher di vetro da 400-600 mL contenente circa 200 mL di acqua utilizzando un forno a microonde. Rimuovere il tubo prima che l’acqua inizi a bollire e vortice il tubo per sciogliere PFA. Lasciare raffreddare la PFA a temperatura ambient…

Representative Results

La digestione della cromatina è uno dei passaggi importanti per un saggio ChIP. Abbiamo usato MNase per digerire la cromatina per ottenere una miscela di oligomeri nucleosomi. Nella fase di digestione di MNase, MNase può passare attraverso la membrana nucleare e digerire la cromatina. Tuttavia, la cromatina digerita non può passare attraverso la membrana e rimane nei nuclei. Per liberare la cromatina digerita dai nuclei, è necessaria una breve sonicazione. Figura 1A mostra microfotografi…

Discussion

Anche se la sonicazione è comunemente usata per ottenere la cromatina frammentata, è dispendioso in termini di tempo e ingombrante identificare le condizioni riproducibili. In questo protocollo, abbiamo usato la digestione di MNase perché la digestione degli enzimi dovrebbe essere più facile identificare le condizioni riproducibili. Un breve passo di sonicazione dopo la digestione di MNase (vedi passo 2.2) è stato necessario per rompere la membrana cellulare e rilasciare la cromatina digerita. Pertanto, la potenza d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è supportata dalle royalties Genentech per City of Hope. Questo lavoro non è supportato in tutto o in parte dai National Institutes of Health.

Materials

0.5 M EDTA (pH 8.0) Thermo Scientific AM9010
2 M KCl Thermo Scientific AM9010
2X iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 1706862
5 M NaCl Thermo Scientific AM9010
50 bp DNA ladder New England Biolabs N3236S
Agarose Research Product International A20090
Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol Millipore Sigma I8896 IGEPAL CA-630
ChIP-grade protein G magnetic beads Cell signaling technology 9006S
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer Millipore Sigma 20-153 Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6X) New England Biolabs B7024S
Glycine Bio-Rad 161-0724 Electropheresis grade
Glycogen Millipore Sigma G1767 19-22 mg/mL
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78445
High Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-155 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl.
Histone H3K4me3 antibody (pAb) Active Motif 39915
LiCl Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-156 Buffer composition: 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1.
Low Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-154 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 well) Millipore Sigma 20-400 Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
Micrococcal nuclease New England Biolabs M0247S comes with 10 x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 @ 25 °C) and 100 x BSA (10 mg/ml)
NaHCO3 JT Baker 3506-01
Normal rabbit IgG Millipore Sigma 12-370
PIPES Millipore Sigma P6757
Proteinase K Millipore Sigma 3115887001
Real-time PCR system Bio-Rad CFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody Active Motif 39749
SDS Boehringer Mannheim 100155 Electropheresis grade
sodium acetate Millipore Sigma S5636
Sonicator equipped with a microtip probe QSONICA Q700 Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Scientific 15593031 pH 8.05

References

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Cite This Article
Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59375, doi:10.3791/59375 (2019).

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