Denne protokollen demonstrerer sekvensiell immunofluorescence og immunhistokjemi på cryosections fra tidlig stadium sebrafisk embryo som muliggjør presise colocalization analyser i spesifikke celle populasjoner.
Gransking av intercellulære interaksjoner krever ofte diskret merking av bestemte celle populasjoner og presis protein lokalisering. Det sebrafisk embryo er et utmerket verktøy for å undersøke slike interaksjoner med en in vivo-modell. Hel-Mount immunhistokjemiske og immunofluorescence analyser er ofte brukt i sebrafisk embryo å vurdere protein uttrykk. Imidlertid kan det være vanskelig å oppnå nøyaktig kartlegging av co-lokaliserte proteiner i tredimensjonale rommet. I tillegg kan enkelte studier kreve bruk av to antistoffer som ikke er kompatible med samme teknikk (f. eks antistoff 1 er bare egnet for immunhistokjemi og antistoff 2 er bare egnet for immunofluorescence). Formålet med metoden som er beskrevet her, er å utføre sekvensielle immunofluorescence og/eller immunhistokjemi på individuelle cryosections avledet fra tidlig stadium sebrafisk embryo. Her beskriver vi bruken av sekvensielle runder med immunofluorescence, bildebehandling, immunhistokjemi, bildebehandling for en enkelt cryosection for å oppnå presis identifisering av protein uttrykk på enkelt cellenivå. Denne metodikken er egnet for enhver studie i tidlig stadium sebrafisk embryo som krever nøyaktig identifisering av flere protein mål i individuelle celler.
Sebrafisk er en ekstremt robust modell organisme som i dag brukes over et bredt spekter av disipliner i biomedisinsk forskning. Spesielt den raske eksterne utvikling og gjennomskinnelighet av sebrafisk embryo gir et utmerket verktøy for in vivo studier. Heri beskriver vi en metode for sekvensiell immunofluorescence (IF) og immunhistokjemiske (IHC) analyser av cryosectioned sebrafisk embryo. Denne romanen prosedyren bruker sekvensiell anvendelse av to antistoffer på et enkelt lysbilde, slik at nøyaktig identifisering av colocalized proteiner på cellenivå samtidig bevare vev seksjoner. Denne protokollen er spesielt nyttig for studier med sebrafisk-modellen, ettersom et relativt lite antall antistoffer er validert for bruk i IF-og/eller IHC-applikasjoner i sebrafisk sammenlignet med musemodeller.
Observasjon av intercellulære interaksjoner er et vesentlig element i mange studier, og kan gi viktig innsikt i molekylære mekanismer fungerer på cellenivå som ligger til grunn fenotyper på organismal nivå. I tillegg kan protein uttrykk gi informasjon om cellulær funksjon, spesielt når du undersøker uttrykk for flere proteiner samtidig i cellen (co-lokalisering). Selv om hel-Mount IHC og hvis er ofte brukt teknikker for å analysere protein uttrykk i sebrafisk embryo1,2,3,4,5, hele Mount prosedyrer kan problematisk for å oppnå presise colocalization data. I vår erfaring, kan det være vanskelig å skille mellom lag av vev og visualisere protein uttrykk på enkelt cellenivå i hel-Mount eksemplarer. Imaging-programmer kan vanligvis ikke skille mellom overflate flekker og dypere farging. Ikke-overflate protein uttrykk kan skjules av mer lys uttrykt overflatenivå uttrykk, noe som fører til unøyaktigheter i kvantifisering. I tillegg er de fleste tradisjonelle sebrafisk clearing metoder ganske giftig6 og dermed mindre ønskelig for bruk.
Antistoff-baserte teknikker, for eksempel IF og IHC, brukes ofte til å påvise protein uttrykk i delt materiale, noe som forenkler identifisering av diskrete celle populasjoner som uttrykker et bestemt protein innenfor komplekst vev. IHC brukes vanligvis til colocalization, oftest ved å bruke to forskjellige antistoffer som bøyes likt i forskjellige verts arter og med forskjellige fargede kromogener4,7,8,9 , 10. imidlertid kan bruk av flere kromogener føre til uspesifisert bakgrunns farging eller inkompatibilitet av farger11,12.
Vi utviklet en ny protokoll for påvisning av flere proteiner ved sekvensiell IF og IHC på cryosectioned tidlig stadium sebrafisk embryo. Kryosnitt er spesielt velegnet til delikate vev som sebrafisk embryo, og cryosections er overlegne i snitt for para fin integrerte seksjoner for fluorescens analyser13,14. Vi valgte å optimalisere kombinert IF og IHC snarere enn dual-farge IF eller IHC, for å omgå problemet med antistoff inkompatibilitet for en enkelt analysetype. Disse problemene er spesielt relevante for forskning som involverer sebrafisk på grunn av det begrensede antall kommersielt tilgjengelige antistoffer som er validert for bruk i sebrafisk. Faktisk viste en studie av fire store selskaper som kommersielt tilgjengelige antistoffer for bruk i musen var ca 112 000 versus ca 5 300 for bruk i sebrafisk15. Til slutt valgte vi å utvikle en protokoll som kunne utføres på en enkelt cryosection, noe som er viktig når du arbeider med små eller begrensede vevsprøver som er innhentet fra sebrafisk embryo.
Denne protokollen ble utviklet for å vurdere proliferativ atferden til donor celler i 48 h post-befruktning chimeric sebrafisk embryo som ble generert av Blastulastadiet-til-Blastulastadiet transplantasjon som beskrevet av Carmany-Rampey og moens16. Donor embryo ble injisert på en celle scenen med en fluorescensmerkete merket dextran bøye før transplantasjon av donor celler i mottaker embryo. Vi brukte immunofluorescence for ser 10 fosforylert histone H3 (pH3) å oppdage voksende celler etterfulgt av immunhistokjemi for merket dextran å oppdage donor celler i chimeric sebrafisk embryo. Sekvensiell påvisning av pH3 og de merkede dextran innenfor en enkelt cryosection gjorde det mulig for oss å identifisere og kvantifisere enkeltceller som uttrykte begge markørene.
Denne sekvensielle IF/IHC-protokollen for cryosectioned sebrafisk vil gi et nyttig verktøy for sebrafisk forskere som ønsker en colocalization protokoll for protein uttrykk. Problemene som denne protokollen ble utviklet for å henvende seg, slik som små vevsprøver og begrenset antistoff tilgjengelighet, er ikke unike for sebrafisk modellen. Denne metoden kan derfor være til nytte for enhver forsker som ønsker å utføre sekvensiell IF/IHC.
ETIKK ERKLÆRING:
Alle dyrestudier ble godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.
Vi har presentert en ny metode for kombinerte immunofluorescence og immunhistokjemi som representerer et viktig skritt framover i å utføre colocalization eksperimenter på cryosectioned sebrafisk embryo. Det er en kritisk mangel på eksisterende colocalization protokoller som er optimalisert for bruk med små embryo og cryosectioned materiale17,18, som begge er ellers ofte brukt i molekylær studier14. Eksisterende colocalization protokoller fokuserer hovedsakelig på samtidig visualisering av to fluorophores17,18. Selv om disse protokollene kan fungere godt, er nytten begrenset av tilgjengeligheten av antistoffer som (i) kan brukes i sebrafisk og (II) er kompatible med IF.
Vi føler at bruk av kryosnitt for sebrafisk embryo gir en betydelig fordel i forhold til bevarte vev morfologi. Som IHC er mer vanlig utført på parafin seksjoner enn cryosections, er videre utforskning av cryosection-baserte IHC metoder for påvisning av protein uttrykk berettiget. Bruk av hele Mount hvis er en vanlig metode for å visualisere uttrykks nivåer i sebrafisk embryo, og er mer vanlig beskrevet i litteraturen enn om bruk av cryosections1,2,3,4, 19i denne. Men hele Mount protokoller har begrensninger, inkludert mangel på nøyaktig lokalisering av proteiner uttrykt i dype vev og potensialet for overflatenivå uttrykk for å skjule protein uttrykk i dypere vev. Vi har konsekvent observert utmerket vedlikehold av cellulær morfologi etter kryonisk bevaring, snitting, og sekvensiell IF og IHC. For programmer som krever presis lokalisering av protein uttrykk på enkelt cellenivå, er det en betydelig fordel for Seksjons BAS ert prosedyrer som vi har beskrevet i denne protokollen. Resin embedding gir et alternativt alternativ for å utføre IF eller IHC analyser på seksjoner fra tidlig stadium sebrafisk embryo20. Resin seksjoner gir overlegen bevaring av vev morfologi i forhold til cryosections, og relativt tynnere vev seksjoner kan være forberedt. Men produsentene generelt ikke anbefaler bruk av harpiks seksjoner for Immuno analyser, som noen komponenter av harpiks ikke kan fjernes fra seksjonene og kan maskere antistoff bindende nettsteder21.
Mens hele protokollen er avgjørende for nøyaktig og vellykket analyse av uttrykks mønstre, noen konkrete skritt er avgjørende for eksperimentell suksess. Det første kritiske trinnet er håndteringen av embryo under innebygging i oktober13,14. Det kan være utfordrende å orientere hvert embryo i samme tverrgående planet slik at seksjonene er kuttet fra omtrent samme område for alle embryo. Vi har funnet at bruk av små gauge nåler for å utføre små, bevisste bevegelser gjennom tyktflytende OCT medium for embryo orientering er overlegen til å bruke tang, som er for store og fortrenge for mye OCT medium. Et annet kritisk trinn oppstår under snitting av frosne blokker, da det kan være vanskelig å få tak i høy kvalitet seksjoner som inneholder ønsket vev (r) uten betydelig opplæring og erfaring. Vi anbefaler derfor bruk av testprøver til teknikken er mestret. Et tredje kritisk trinn er dekkglass fjerning, som har potensial til å forstyrre eller fjerne vevsprøver. Vi har funnet at en kombinasjon av skånsom agitasjon for å løsne dekkglass og langsom fjerning av raset fra PBS beholderen er den mest effektive tilnærmingen for å fjerne coverslips. En mild og stødig hånd er best; Forskerne kan oppleve at noen prøving og feiling er nødvendig for å lære å fjerne coverslips effektivt.
Ytterligere viktige trinn i protokollen inkluderer antistoff optimalisering (primære og sekundære antistoffer for både IF og IHC analyser) og eksponering av lysbilder til kromogen substrat og counterstain. Grundige undersøkelser om primære antistoff spesifisitet og mål konsentrasjon er avgjørende; Generelt er det best å samle inn tilstrekkelige ikke-dyrebare prøver for minst to separate eksperimenter for IF og IHC som skal utføres for å optimalisere primære antistoff konsentrasjoner før du starter IF/IHC kombinasjon. Å inkludere en kjent positiv og negativ kontroll for hvert primære antistoff er essensielt i hvert eksperiment for å sikre at både IF-og IHC-analysene fungerer riktig. Justeringer av sekundær antistoff konsentrasjon kan også være nødvendig. Optimalisering av eksponering av vevs deler til kromogen substrat og counterstain for IHC-analysen er nødvendig, siden produsentens retningslinjer ofte beskriver et bredt spekter av mulige eksponeringstider. Ikke alle kromogener kan være kompatible med counterstains og endogene vev pigmentering, som krever nøye planlegging med hensyn til kromogen utvalg.
Det er mange potensielle endringer som kan anvendes på protokollen som er beskrevet, og vi har utført denne protokollen med andre kombinasjoner av antistoffer som ikke kunne begge brukes for IF. Som antydet ovenfor, kromogen stoffer har distinkte kompatibilitet med bestemte counterstains. Vi har funnet ut at disse komponentene er lett å modifisere i protokollen. I tillegg er parametrene for antistoff inkubasjons ganske fleksible, og kan økes eller reduseres avhengig av ønsket farge intensitet. Prosessen for innebygging kan også endres. Mens vi har fokusert på tverrgående seksjoner, kan embryo lett bli orientert i alle retninger for å ta opp bestemte vev av interesse. Til slutt er det flere mulige pause punkter i denne protokollen. Dehydrert embryo kan lagres i 100% MeOH ved-20 ° c for et par måneder; frosne blokker kan oppbevares ved-80 ° c i opptil tre måneder; og preparerte lysbilder kan lagres ved-80 ° c i opptil ni måneder i en lysbilde boks.
På grunn av den relative kompleksiteten av denne kombinerte IF/IHC-protokollen, finnes det flere mulige kilder til variasjon eller feil som kan kreve feilsøking, alt fra vevs kvalitet til forsker opplevelse for å prøvehåndtering. De fleste av de kritiske trinnene som er beskrevet ovenfor, anses som kritiske fordi de enten krever optimalisering på det individuelle bruker nivået, eller de krever spesiell fingerferdighet, ferdighet og erfaring. Vi har imidlertid funnet at spesifikk bakgrunn farging og lav signal intensitet er de viktigste problemene som krever optimalisering. Som med enhver IF-eller IHC-protokoll, kan det å ta opp disse problemene være tidkrevende og arbeidsintensiv, og kan bli forsterket med denne metoden siden de to teknikkene kombineres. Av denne grunn anbefaler vi på det sterkeste å optimalisere IF og IHC separat før du fortsetter med den kombinerte protokollen.
Selv om vi spår at denne metoden vil være nyttig for et bredt spekter av eksperimenter, er det potensielle begrensninger. Vellykket utførelse av denne prosedyren er avhengig av å opprettholde intakt vevsprøver gjennom to sekvensielle eksperimenter som inkluderer en rekke vasketrinn. Av denne grunn vil eventuelle problemer som oppstår under snitting eller vevs håndtering, inkludert bruk av eldre lysbilder som kan ha dårligere kvalitet, i betydelig grad begrense forskerne evne til å utføre denne protokollen vellykket. Selv om lysbildene kan lagres ved-80 ° c i opptil ni måneder, reduseres vevs overholdelse over tid, og vi hadde den beste suksessen med lysbilder som brukes innen en måned med forberedelser eller ideelt, neste dag. En annen begrensning er den lille fotavtrykk av sebrafisk embryo. Selv om vi har funnet dette eksperimentet til å være nyttig for å visualisere proteiner som er relativt rikelig uttrykt i tidlig stadium embryo, kan proteiner som uttrykkes inkonsekvent eller ved lave nivåer være svært vanskelig å fange i en seksjon. Til slutt, siden protokollen bruker 10 \ u201212 μm cryosections, er det best egnet for evaluering av protein uttrykk i større strukturer, for eksempel kjerner, snarere enn mindre sub-cellulære komponenter.
Oppsummert vil vår kombinerte IF/IHC-protokoll være en fordel for en rekke studier i tidlig stadium sebrafisk embryo, og representerer en viktig innovasjon i presise protein uttrykk analyse i slike eksemplarer. Vår metode, vist med suksess i figur 5, vil tillate forskere å bevare den delikate morfologi av tidlig stadium sebrafisk embryo i cryosections mens du arbeider med noe begrenset utvalg av tiden tilgjengelig primære antistoffer som er godkjent for bruk i IF eller IHC i denne arten. Denne protokollen vil trolig være nyttig for studier i andre fiske-og amfibier arter (f. eks Medaka og Xenopus spp.), som er hemmet av lignende begrensninger for antistoff tilgjengelighet, og kan være aktuelt for tradisjonelle pattedyr modeller som Godt.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant 5K01OD021419-02 og NC State University College of Veterinary Medicine.
15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2000 dilution in block buffer for IF |
Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
Background Buster | Innovex | NB306 | |
block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1X PBS |
cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
Ethanol | Koptec | V1001 | |
fish gelatin | Sigma | G7041 | |
Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
Methanol | Fisher | A452-4 | |
Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2M KCl |
Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
Permount | Fisher | SP15 | |
1X phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
10X phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
1X PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
sucrose | Amresco | 335 | |
Tween-20 | Fisher | BP337 | |
TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1000 in 1x PBS for IF |
1X Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
1X TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL |