Cryosec, zebrafish embriyo üzerinde sıralı Immünofluorescence ve Immünhistokimya

1. embriyo hazırlama Fix 48 h sonrası fertilizasyon (HPF) chimerik zebra balığı embriyo tarafından oluşturulan Blastula-Blastula nakli arasında AB Wild-tipi zebra balığı embriyoları arasında 4% civarında formaldehite (PFA) gecede 4 °c ‘ de sallanan ile. 500 μL kullanarak oda sıcaklığında sallanan iki 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin 1x fosfat tamponlu tuz içeren% 0,1 olmayan bir iyonik yüzey (1x PBSt; malzeme tablosunabakın)Not: Paraformaldehyde toksik ve kanserojen olup, kurumsal düzenlemeler başına düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir. Paraformaldehit ile çalışma bir kimyasal kaput yapılmalıdır, ve uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuar ceket, ve güvenlik gözlükleri) her zaman kullanılmalıdır. 500 μL% 30,% 50 ve% 70 metanol (MeOH) ile 10 dakika boyunca her biri sallanan oda sıcaklığında 1 PBSt ile seyreltilmiş embriyoların kurutması. En az 14 h için 500 μL/% 100 MeOH-20 °C ‘ de embriyoları inkük et.Not: Metanol zehirlidir ve kurumsal düzenlemeler başına düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir. Metanol ile çalışma bir kimyasal kaput yapılmalıdır, ve uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuar ceket, ve güvenlik gözlükleri) her zaman kullanılmalıdır. 500 μL% 70,% 50 ve% 30 MeOH ile 1 PBSt ile 10 dakika boyunca her oda sıcaklığında sallanan ile seyreltilerek embriyoların rehidrat. Sallanan ile Oda sıcaklığında 1x PBSt 500 μL ile iki 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin. 1x PBST çıkarın ve 500 μL in% 30 sakaroz, embriyolar tüpün alt kısmına kadar sallanan ile Oda sıcaklığında deiyonize su ile seyreltilmiş (yaklaşık 1 saat). % 15 balık jelatin/% 25 sakaroz (15/25; malzeme tablosunabakın) 500 μL ile sukrose değiştirin ve gece sallanan ile Oda sıcaklığında inküye. 15/25 hacminin yaklaşık yarısını optimum kesme sıcaklığı Orta (OCT orta) ile değiştirin ve embriyolar tüpün alt kısmına kadar sallanan oda sıcaklığında inküye (yaklaşık 1 saat). EKIM orta hacminin yaklaşık yarısını değiştirin ve 1 h için sallanan ile Oda sıcaklığında inküye. bu adımı bir kez daha tekrarlayın. 15/25 ve OCT orta ile inkübasyon adımları sırasında, bu reaktifler birleştirmek için gerektiği gibi tüp ters çevirme veya fiske. 2. embriyo gömme ve Kriyobölümlerin hazırlanması Embriyoları plastik bir kalıp ( malzeme tablosunabakın) forseps ile aktarın, 15/25-Oct karışımı herhangi bir transfer minimize. EKIM orta ile yaklaşık yarım tam kalıp doldurun ve hafifçe OCT orta embriyolar karıştırın. Hazırlamak etiketli plastik kalıplar ve transfer istenen embriyolar (genellikle 1 \ u20123 embriyo) içine boş, etiketli plastik kalıplar, taşıma en aza indirmek EKIM orta. İstenilen embriyolar plastik kalıp içinde ise, yavaşça kalıp üstüne OCT orta ile doldurun. Görselleştirme için hafif bir mikroskoptan kullanarak embriyoları istenilen yönde düzenlemek için forseps veya 25 G iğne kullanın (Şekil 1a, B). Metal bir platform ile yalıtılmış bir kap içinde kuru buz üzerinde hazırlanmış kalıpları dondurun. Soğuk bir oda oluşturmak için metal platformunun üzerine yavaşça bir buz kovası veya köpük soğutucusu yerleştirin (Şekil 1C, D) -20 °C ‘ de bir kriyostat seti kullanarak 10 \ u201212 μm kalınlığında kriyobölüm hazırlayın. Bir defada bir blok ayarlayın ve bloğu (Şekil 2a) doğru bakacak şekilde bloğun alt kısmına sahip disk/ayna üzerine blok dondurmak için Oct orta kullanın. Kesme işleminden önce bloğun diske tamamen Dondurulmuş olduğundan emin olun (OCT ortamı beyaz olacak) (Şekil 2B). Şarj edilmiş cam slaytlara (Şekil 2C, D) kriyobölümler yerleştirin ve hava-kuru gece oda sıcaklığında slaytlar. 3. pH3 için immünofluorescence Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynır içinde 1x PBS ‘de slaytların üç 5 dakika yıkamaya gerçekleşmesini yapın. Dokuların kaydıra iyi yapışmaz ise, düz bir yüzey üzerinde slaytlar döşeme ve yavaşça pipetleme 500 μL 1 PBS yüzeye üzerine kayar. Yavaşça slaytları açarak yıkanmaları arasında 1x PBS dökün. Slaytlar üzerinde sıvı tutmak için bir bariyer kalemi veya balmumu kalem ile bölümler anahat (Şekil 3). Slaytları, nemli bir odada düz bir yüzeye ve pipet 200 μL ‘ye her bölüm için slaytlar üzerine yerleştirin. Oda sıcaklığında 2 saat veya 4 °C ‘ de bir gecede blok tamponunun içinde kulbirer atın. Birincil antikor seyreltme hazırlayın (tavşan Anti-pH3 antikor, 1:200; bkz. malzeme tablosu) blok tampon ve karışımı iyi pipetleme ile. Blok tamponunu boşaltmak için slaytları hafifçe ucu, nemli odasına dönün ve 200 pipet, slayt üzerine bölüm başına primer antikor çözeltisi μL. Yalnızca ikincil denetim için pipet 200 μL blok arabelleği uygun bölümler üzerine. Bir gecede 4 °C ‘ de, deiyonize su ile dolu nemli bir odada slaytları kulbe etme. Nemi muhafaza etmek için nemli odanın kenarlarını mühürleyin. Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynır içinde 1x PBS ‘de slaytların üç 5 dakika yıkamaya gerçekleşmesini yapın. Yıkama adımları sırasında, ikincil antikor seyreltme hazırlamak (Anti-tavşan floresan ikincil antikor Konjugat, 1:2000; malzeme tablosunugörmek) blok tampon ve karışımı iyi pipetleme ile. Slaytlar üzerinde bir nemli oda ve pipet 200 μL ikincil antikor çözeltisi slayt üzerine bölüm başına düz bir yüzeye yerleştirin. Orta antikor çözeltisi (ler) nda, 30 dakika boyunca ışık korumalı oda sıcaklığında slaytları kulyın. Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir kapsayıcıda 1x PBS ‘de slaytların üç adet 5 dakika yıkanıyor, ışıktan korunan. Yıkama adımları sırasında, bir nükleer boyama çözeltisi hazırlayın ( malzeme tablosunabakın). Slaytları düz bir yüzeye yerleştirin ve her bölüme nükleer boyama çözeltisi için 200 \ u2012500 μL (numune boyutuna bağlı olarak) pipet takın. Nükleer boyama çözeltisi içinde slaytları 10 dakika boyunca ışıktan korunur. Nükleer boyama çözeltisi boşaltın ve olmayan sertleştirici floresan montaj medya ve bir cam coverslip ile slaytlar monte. Görüntüleme gerçekleştirilinceye kadar karanlıkta slaytları 4 °C ‘ de koruyun.Not: En iyi sonuçlar, slaytlar aynı gün veya ertesi gün görüntülenmiş olduğunda elde edilir. Eğer 100 x büyütme (10X oküler büyütme ve 10X objektif büyütme) 555 Nm (kırmızı) ve 645 Nm (uzak kırmızı) emisyon filtreleri kullanarak bir konfokal floresan mikroskop ve dijital kamera ile slaytları görselleştirin ve görselleştir. Lazer gücünü görüntüleme boyunca tutarlı tutun. Görüntüleme işleminden sonra, slaytları 1x PBS bireysel konteynerlerde yerleştirin ve 4 °C ‘ de düz olarak saklayın. Slaytları 1x PBS ‘ye yerleştirirken, coverslunun çıkarılmasına yardımcı olmak için slaytları yavaşça karıştırın.Not: Bu bölümlerin kalitesini tehlikeye atabilir gibi lamel magazini üzerine basmayın veya el lamel magazini kaldırmak için girişimi. Coverfiş en az zorunlu hareket ile yatay olarak kaldırılmalıdır. 4. etiketlenen dextran için immünhistokimya Coverflar kaldırıldıktan sonra, slaytları bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynır içinde yeni 1x PBS ‘ye hafifçe aktarın. 1x PBS kaldırın ve 1x Tris-tamponlu tuz% 0,1 ile üç 5 dk kulkaylar gerçekleştirmek olmayan bir iyonik yüzey (1x TBSt) Oda sıcaklığında. Hazırlamak 250 mL 3% hidrojen peroksit (H2O2) deiyonize suda uygun boyutta bir konteyner seyreltilmiş. Slaytları 3% H2O2 ‘ de oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inküle.Not: Hidrojen peroksit korozif ve düzgün kurumsal düzenlemeler başına bertaraf edilmelidir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuar ceket ve güvenlik gözlükleri) her zaman kullanılmalıdır. Hızlı bir şekilde deiyonize su ile slaytlar durulayın. 1x TBSt içinde slaytların üç 5 dk yıkayıcıları gerçekleştirin. dikkatle doku bölümlerinin çevresindeki alanı kurutun ve slaytlar nemli bir odaya düz yerleştirin. Gerekirse bölümlerde sıvı tutmak için bir bariyer kalem veya balmumu kalem ile doku bölümlerini anahat. Bir ikincil antikor etiketleme kiti ile sağlanan hazır kullanım 2,5% serum engelleme çözeltisi uygulayın ( malzeme tablosunabakın) her bölüme dropwise. Nemli bir odada, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytları kulyın. Antikor seyreltilmiş primer antikor hazırlama (tavşan Anti-etiketli dextran, 1:7500; malzeme tablosunabakın) ve nazik pipetleme ile karıştırın. Blok tamponunu boşaltıp, bölümlerin çevresindeki alanı kurutmak ve slaytları nemli bir odaya yerleştirmek için yavaşça ucu kaydırın. Primer antikor çözeltisi uygulamadan önce yıkanmayın. Pipet 200 μL, kesit başına ana antikor çözeltisi slaytlara ve 4 °C ‘ de nemli bir odada kuluçşurada. Sadece ikincil kontrol için, pipet 200 uygun bölümlere antikor seyreltilme μL. Birincil antikor çözeltisi ve bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynırın içinde 1x TBSt ‘de yer boşaltmak için slaytları hafifçe uç. 1x TBSt içinde slaytların iki 5 dk yıkayıcıları gerçekleştirin. bölümlerin çevresindeki alanı kurutun ve nemli bir odaya yerleştirin. Kullanıma hazır bir arka plan azaltma engelleme reaktif ( malzeme tablosunabakın) her bölüme dropwise uygulayın. Nemli bir odada, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytları kulyın. Blok tamponunu boşaltmak için slaytları hafifçe uç, bölümler çevresindeki bölgeyi dikkatlice kurutun ve slaytları nemli bir odaya yerleştirin. İkincil antikor çözeltisi uygulamadan önce yıkanmayın. Kullanım hazır ikincil antikor çözeltisi (Anti-tavşan horserpu peroksidaz (HRP) polimer ikincil antikor; malzeme tablosunabakın) her bölüm dropwise ve 30 dakika oda sıcaklığında nemli bir odada inkük. İkincil antikor çözeltisi ve bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynır içinde 1x TBSt içinde yer boşaltmak için yavaşça uç slaytlar. 1x TBSt içinde slaytların iki 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin. Üreticinin protokolüne göre hemen kullanmadan önce HRP kromojenik substrat hazırlayın ( malzeme tablosunabakın). Bölümlerin çevresindeki alanı kurutun, slaytları düz bir yüzeye yerleştirin ve her bölüme HRP kromojenik substrat 200 μL uygulayın. İlk slaytta substrat uygulandığında bir Zamanlayıcı başlatmak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe (Şekil 4). Substrat çözeltisi boşaltın ve 1x PBS içeren bir Coplin kavanozunda slaytları kısaca durulayın. Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynerin içinde deiyonize suya slaytlar yerleştirin ve nazik ajitasyon ile deiyonize suda iki 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin. 30 sn. ‘ ye kadar hematoksilen boyama çözeltisi içine yerleştirerek slaytları counterstain.Not: Hematoksilin zehirlidir ve kurumsal düzenlemelere göre bertaraf edilmelidir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuar ceket ve güvenlik gözlükleri) her zaman kullanılmalıdır. Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynerin içinde deiyonize suya slaytlar yerleştirin ve deiyonize suda üç 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin. Slaytları Scott ‘ın musluk suyunu içeren bir kapsayıcıya aktarın ( malzeme tablosunabakın) ve 1 dakika boyunca inküye yapın. Bir Coplin kavanozu gibi uygun bir konteynerin içinde deiyonize suya slaytlar yerleştirin ve deiyonize suda üç 5 dk yıkanıyor gerçekleştirin. Bir kimyasal kaput içinde etanol (EtOH) notları (deiyonize suda seyreltilmiş) ve ksilon bir dizi ile slaytlar susuz. 70% EtOH ‘da bir 2 dk kuluçk gerçekleştirin,% 95 EtOH ‘de iki 1 dak,% 100 EtOH ‘da iki 1 dakika inkübasyon ve Ksilin içinde üç adet 1 dak. Ksilden slaytları çıkarın ve kimyasal bir kapta Toluen tabanlı montaj ortamı ile ıslak iken bir lamel magazini yerleştirin.Not: Ksilon ve Toluen toksik ve yanıcı olup, kurumsal düzenlemeler başına düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir. Ksilol ve Toluen ile çalışma bir kimyasal kaput yapılmalıdır, ve uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuar ceket, ve güvenlik gözlükleri) her zaman kullanılmalıdır. IFC takipte, 100 x büyütme (10X oküler büyütme ve 10X objektif büyütme) ile bileşik ışık mikroskobu ve dijital kamera ile slaytlar görselleştirin ve görüntü. (Şekil 5).