Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van thiazole oranje voor de opsporing van DNA in gel elektroforese experimenten. Het gebruik van thiazole oranje kunt eliminatie van ethidiumbromide en fluorescentie detectie kan worden bereikt met UV of blauw licht.
DNA gelelektroforese met behulp van agarose is een gemeenschappelijk instrument in moleculaire biologie laboratoria, waarmee een scheiding van de fragmenten van DNA door grootte. Na scheiding, is DNA gevisualiseerd door kleuring. Dit artikel laat zien hoe u thiazole oranje om vlek DNA. Thiazole oranje vergeleken gunstig met gemeenschappelijke kleuring methoden, in die zin dat het gevoelige, goedkope, prikkelbaar met UV- of blauw licht (monster om schade te voorkomen) en veiliger dan ethidiumbromide. Laboratoria die reeds uitgerust is om uit te voeren van de experimenten van DNA elektroforese gebruik van ethidiumbromide kunnen kleurstoffen met geen aanvullende wijzigingen in het algemeen overschakelen naar bestaande protocollen, met behulp van UV-licht voor detectie. Blauw-licht detectie om te voorkomen dat monster schade kan bovendien worden bereikt met een blauw-licht bron en emissie-filter. Labs reeds uitgerust voor blauw-licht detectie kunnen kleurstoffen met geen aanvullende wijzigingen eenvoudig overschakelen naar bestaande protocollen.
Het doel van deze methode is om te identificeren van DNA in agarose gel met behulp van thiazole oranje (TO) voor de detectie van de fluorescentie. Door zijn lage kosten en gunstige veiligheidsprofiel, kan thiazole oranje bepaald voordeel in undergraduate onderwijs labs en onderzoeklaboratoria uitvoeren van moleculaire biologie, met name ligations en klonen ziet.
Ethidiumbromide blijft de meest voorkomende kleurstof voor opsporing van DNA in agarose gel. Dit is vooral omdat het zeer goedkoop kan worden verkregen en vereist alleen excitatie met UV-licht voor detectie. Beide ethidium bromide en thiazole oranje zijn goedkoop, met lage detectie limieten (1-2 ng/lane)1. Er zijn twee belangrijke nadelen aan ethidiumbromide, echter dat thiazole oranje verbetert.
Eerst, ethidiumbromide is een mutagen2 met speciale verwerking en verzending en over verwijdering eisen, terwijl thiazole oranje minder mutagene is (3-4 x minder mutageen in Ames-test)3,4 en kan worden over het algemeen afgezet met gemeenschappelijke chemisch afval.
Ten tweede vereist ethidiumbromide UV-licht voor detectie. Thiazole oranje ook UV-licht kunt gebruiken, indien gewenst, maar kan ook worden gedetecteerd met blauw licht. UV-licht, heeft terwijl gebruikte, een paar saillante nadelen. Ten eerste, het is schadelijk voor de menselijke huid en ogen. Hoewel UV-licht kan veilig gebruikt worden door daartoe opgeleide beroepsbeoefenaren, schade door een ongeluk huid of oog (functioneel vergelijkbaar met zonnebrand) uit laboratorium UV licht zijn niet ongewoon vooral met onervaren wetenschappers. Ten tweede, UV-licht is uiterst schadelijk voor DNA monsters5, waardoor het succes van downstream experimenten (zoals afbinding en transformatie)1,6,7. AAN maakt de ontdekking met blauw licht (λex, max = 510 nm (488 nm en 470 nm Toon ook sterke excitatie)), die veroorzaakt geen huid schade of DNA schade (hoewel een intens licht kan nog steeds schadelijk voor de ogen), sterk verminderen van de risico’s voor zowel de wetenschapper en het monster.
Is niet het slechts fluorescente kleurstof alternatief voor ethidiumbromide; het voordeel is kosten. AAN werd ontdekt in de jaren 1980 als een Retikulocyt vlek8, en nut heeft gevonden in een aantal DNA gebaseerde fluorescentie experimenten9,10,11,12,13. Het is op dit moment verkocht door meerdere leveranciers. Is de bovenliggende compound van extra, duurder, blauw-licht-detecteerbare commerciële kleurstoffen en zich gedraagt als tijdens elektroforese, met behulp van UV- of blauw licht voor detectie1. Bovendien, terwijl andere kleurstoffen gevoeliger voor zeer lage concentraties van DNA dan EtBr of aan, voor generieke elektroforese experimenten zijn, dergelijke kleurstoffen zijn onbetaalbaar in vele contexten.
Ethidiumbromide is al lang een standaardhulpmiddel in de moleculaire biologie lab, ondanks bekende toxiciteit. Het lijdt ook waarbij UV-licht, die het DNA schade zoals het wordt ontdekt. Thiazole oranje biedt een goedkoop alternatief voor ethidiumbromide, evenals nuttig, maar dure commerciële kleurstoffen.
De voordelen van thiazole oranje zijn dus tweeledig. Eerst, thiazole oranje kan gewoon worden gebruikt als vervanging aan ethidiumbromide. Gels kunnen identiek aan EtBr, met aan vervangen a…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door opstarten middelen aan TDG van Christopher Newport University.
2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
*Glasses are also included with Invitrogen G6600 |