DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Thiazole orange für den Nachweis von DNA in Gel-Elektrophorese Experimente verwenden. Die Verwendung von Thiazole Orange ermöglicht Beseitigung der Interkalation Bromid und Fluoreszenz-Detektion mit UV oder blaues Licht erreicht werden.
Abstract
DNA Gelelektrophorese mit Agarose ist ein gemeinsames Tool im molekularbiologischen Labor, Trennung von DNA-Fragmenten durch Größe. Nach der Trennung ist DNA durch Färbung sichtbar gemacht. Dieser Artikel veranschaulicht, Thiazole orange Fleck DNA zu nutzen. Thiazole Orange im Vergleich zu gemeinsamen Färbung Methoden, insofern er empfindlich, kostengünstig, leicht erregbaren mit UV- oder blaues Licht (zum Beispiel Schäden zu verhindern) und sicherer als Interkalation Bromid. Labs bereits ausgestattet, um DNA Elektrophorese Experimente mit Interkalation Bromid laufen können in der Regel Farbstoffe mit keine zusätzlichen Änderungen in bestehenden Protokolle, mit UV-Licht zur Erkennung. Blaulicht-Erkennung zu Probe vermeiden kann zusätzlich mit einem Blaulicht-Quelle und Emission Filter erreicht werden. Labs bereits für Blaulicht-Erkennung ausgestattet können einfach Farbstoffe mit keine zusätzlichen Änderungen in bestehenden Protokolle.
Introduction
Der Zweck dieser Methode ist, DNA in Agarose-Gele mit Thiazole orange (bis) für Fluoreszenz-Detektion zu identifizieren. Wegen seiner niedrigen Kosten und günstige Sicherheitsprofil Thiazole Orange sehen möglicherweise besonderen Vorteil grundständige Lehre Labs und Forschungslabors Durchführung Molekularbiologie, insbesondere Verbindlichkeiten und Klonen.
Interkalation Bromid bleibt der am häufigsten verwendete Farbstoff für die Erkennung von DNA in Agarose-Gele. Dies ist vor allem, weil es sehr kostengünstig bezogen werden kann und erfordert nur Anregung mit UV-Licht zur Erkennung. Beide Interkalation Bromid und Thiazole Orange sind billig, mit niedrigen Erkennung Grenzen (1 bis 2 ng/Bahn)1. Es gibt zwei Hauptnachteile Interkalation Bromid, jedoch zu, denen auf Thiazole Orange verbessert.
Erstens Interkalation Bromid ist ein Mutagen2 mit Sonderbehandlung, Lieferung und Entsorgung Anforderungen, während Thiazole Orange weniger Mutagene (3 – 4 X weniger erbgutverändernd im Ames-Test)3,4 und in der Regel mit entsorgt werden allgemeine chemische Abfälle.
Zweitens erfordert die Interkalation Bromid UV-Licht zur Erkennung. Thiazole Orange kann ähnlich wie UV-Licht, falls gewünscht, aber auch mit blauem Licht erkannt werden. UV-Licht, hat während allgemein verwendet, ein paar markante Nachteile. Erstens ist es schädlich für menschliche Haut und Augen. Während UV-Licht sicher von ausgebildeten Fachleuten verwendet werden kann, Haut oder Auge Unfallschäden (funktionell ähnlich Sonnenbrand) vom Labor UV-Licht sind nicht ungewöhnlich, vor allem bei unerfahrenen Wissenschaftler. Zweitens ist UV-Licht äußerst schädlich für DNA-Proben5, die den Erfolg von nachgelagerten Experimente (z. B. Ligatur und Transformation)1,6,7reduziert. TO ermöglicht die Erkennung mit blauem Licht (λEx, max = 510 nm (488 nm und 470 nm zeigen auch starke Erregung)), die verursacht keine Schädigung der Haut oder DNA schädigen (obwohl kein intensives Licht möglicherweise noch schädlich für die Augen), stark verringern die Risiken für beide der Wissenschaftler und der Probe.
Ist nicht nur Fluoreszenzfarbstoff-Alternative zur Interkalation Bromid; sein Vorteil ist Kosten. In den 1980er Jahren als eine Retikulozytenzahl Fleck8entdeckt wurde, und hat in einer Reihe von DNA-basierten Fluoreszenz Experimente9,10,11,12,13Dienstprogramm gefunden. Es wird derzeit von verschiedenen Anbietern verkauft. Ist die Ausgangssubstanz von zusätzlicher, teurer, blau-Licht – nachweisbar kommerzielle Farbstoffe, und verhält sich ähnlich wie während der Elektrophorese, mit UV- oder blaues Licht für Erkennung1. Während andere Farbstoffe empfindlicher auf sehr geringen DNA-Konzentrationen als EtBr oder TO, für generische Elektrophorese Experimente sind, sind darüber hinaus solche Farbstoffe unerschwinglich teuer in vielen Kontexten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Interkalation Bromid ist seit langem ein Standardwerkzeug in der molekularbiologischen Labor, trotz bekannten Toxizität. Es leidet auch unter UV-Licht, die die DNA schädigt, da es erkannt wird, erfordern. Thiazole Orange bietet eine kostengünstige Alternative zur Interkalation Bromid, sowie nützliche, aber teure kommerzielle Farbstoffe.
Die Vorteile von Thiazole Orange sind somit zwei-Fach. Thiazole Orange ist zunächst nur als Ersatz für die Interkalation Bromid einsetzbar. Gele können …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Startup-Fonds zu TDG von Christopher Newport University unterstützt.
Materials
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 |
References
- O’Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
- Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
- Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. . Molecular Probes, Inc. , (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
- Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
- Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
- Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
- Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
- Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
- Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
- Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
