نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحسين وظيفة القلب في فئران ضمور العضلات دوشين عابر بزرع اكسوسوميس المستمدة من الخلايا السلف شذوذ عادي.
دوشين ضمور العضلات (DMD) العاشر مرتبطة المتنحية وراثية مرض الناجم عن نقص البروتين ديستروفين الوظيفية. لا يمكن الشفاء من المرض، وكلما تقدم المرض، يطور المريض أعراض المتوسعة اعتلال عضلة القلب وعدم انتظام ضربات القلب، وفشل القلب الاحتقاني. الفئران DMDMDX متحولة لا تعبر عن ديستروفين، وتستخدم عادة كنموذج الفأر من إعلان الدوحة الوزاري. وفي دراستنا الأخيرة، لاحظنا أن حقن إينتراميوكارديال من نوع واسعة (WT)-عابر استعادة السلف شذوذ المستمدة من الخلايا اكسوسوميس (MPC-أكسو) التعبير عن ديستروفين في عضلة القلب الفئران DMDMDX المسخ، الذي ارتبط مع تحسن عابر في وظيفة القلب، مما يوحي بأن وزن-MPC-أكسو قد توفر خيار للتخفيف من أعراض أمراض القلب من إعلان الدوحة الوزاري. توضح هذه المقالة التقنية لتنقية MPC-أكسو وزرعها في قلوب الفئران متحولة DMDMDX .
دوشين ضمور العضلات (DMD) العاشر مرتبطة المتنحية، تقدمية العضلية مرض تسببه طفرة في جين DMD وفقدان ديستروفين الفنية1. ديستروفين تتجلى أساسا في العضلات الهيكلية وعضلة القلب، ويتم التعبير عن أقل في العضلات الملساء والغدد الصماء والخلايا العصبية2،3. DMD هو النوع الأكثر شيوعاً من ضمور العضلات مع معدل واحد لكل 3,500 إلى 5,000 الأولاد حديثي الولادة في جميع أنحاء العالم4،5. عادة وضع الأفراد نخر العضلات التدريجي، فقدان المشي المستقلة خلال مرحلة المراهقة المبكرة، والموت في العقود الثانية إلى الثالثة من حياتهم بسبب فشل القلب، وفشل في الجهاز التنفسي6.
المتوسعة اعتلال عضلة القلب وعدم انتظام ضربات القلب الاحتقاني مظاهر القلبية الوعائية شائعة DMD7،8. لا يمكن الشفاء من المرض، والعلاج الداعم قد تحسين الأعراض أو تأخير تطور قصور القلب، ولكن من الصعب جداً لتحسين وظيفة القلب9،10.
مماثلة للمرضى DMD، ضمور العضلات المرتبطة بالعاشر الفئران (MDX) تعاني من نقص في البروتين ديستروفين، وهذا أعراض اعتلال عضلة القلب11، وثم تستخدم على نطاق واسع في البحوث اعتلال عضلة القلب DMD المرتبطة. من أجل استعادة ديستروفين في العضلات المتأثرة، أثبت العلاج بالخلايا الجذعية متمكنة يمكن علاج فعال لإعلان الدوحة الوزاري12،،من1314. اكسوسوميس، شمال البحر الأبيض المتوسط 30-150 غشاء الحويصلات يفرز من مختلف أنواع الخلايا، تلعب دوراً أساسيا في الاتصالات خلية إلى خلية عن طريق نقل المواد الجينية، مثل الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) والترميز غير الكشف15،16،17 ،،من1819،،من2021.
وأظهرت دراساتنا السابقة أن اكسوسوميس المستمدة من الخلايا السلف شذوذ (MPC)، مثل خط الخلية C2C12، يمكن نقل ديستروفين مرناً للمضيف cardiomyocytes بعد22من الحقن المباشر للقلب، مشيراً إلى أن تسليم متمكنة يمكن استعادة اكسوسوميس المستمدة من السياسة النقدية (MPC-أكسو) عابر DMD الجينات في الفئران MDX. تركز هذه المقالة على تقنيات تنقية وزرع MPC-أكسو.
الطريقة لعزل اكسوسوميس النقي ضروري لدراسة وظيفة اكسوسوميس. أحد الأساليب الشائعة لعزل اكسوسومي من البولي إيثيلين الجليكول (أوتاد) بوساطة الأمطار17،،من1825. اكسوسوميس يمكن أن تكون عجلت في أوتاد، والقريبون من الطرد المركزي ذات سرعة منخفضة. ت?…
The authors have nothing to disclose.
تانغ كانت تدعمها جزئيا في “جمعية القلب الأمريكية”: GRNT31430008، AR070029 المعاهد الوطنية للصحة، والمعاهد الوطنية للصحة-HL086555، HL134354 المعاهد الوطنية للصحة.
0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
Centrifuge | Unico | C8606 | |
Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
DMEM | Corning | 10-013-CM | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |