Summary

Studeren oxidatieve Stress veroorzaakt door de streptokokken groep Mitis in Caenorhabditis elegans

Published: March 23, 2019
doi:

Summary

De nematode Caenorhabditis elegans is een uitstekend model te ontleden gastheer-pathogeen interacties. Hier beschreven is een protocol te infecteren de worm met leden van de mitis groep streptokokken en activering van de oxidatieve stressrespons tegen H2O2 geproduceerd door deze groep van organismen te bepalen.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans), een free-living nematode, heeft ontpopt als een aantrekkelijk model te bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties. Dit model wordt in het gepresenteerde protocol gebruikt om te bepalen van de pathogeniteit veroorzaakt door de mitis groep streptokokken via de productie van H2O2. De mitis groep streptokokken zijn een nieuwe bedreiging die ervoor zorgen dat vele menselijke ziekten zoals bacteriëmie endocarditis en orbitale cellulitis (sinaasappelhuid). Hier beschreven is een protocol om het voortbestaan van deze wormen in reactie op H2O2 geproduceerd door deze groep van ziekteverwekkers. Met behulp van de gene skn-1 codering voor een oxidatieve stress reactie transcriptiefactor, wordt aangetoond dat dit model belangrijk zijn voor de identificatie van de host-genen die essentieel zijn tegen streptokokken infectie. Bovendien is aangetoond dat de activering van de oxidatieve stressrespons kan worden gecontroleerd in de aanwezigheid van deze ziekteverwekkers met behulp van een transgene verslaggever worm stam, waarin SKN-1 is gesmolten tot groen fluorescente proteïne (GFP). Deze tests bieden de mogelijkheid om te studeren van de oxidatieve stress reactie op H2O2 afgeleid door een biologische bron in tegenstelling tot exogenously reactieve zuurstof soorten (ROS) bronnen toegevoegd.

Introduction

Mitis groep streptokokken zijn menselijke commensals van de orofaryngeale holte1. Deze organismen kunnen echter ontsnappen deze niche en een verscheidenheid van invasieve ziekten2veroorzaken. De infecties veroorzaakt door deze micro-organismen bevatten bacteriëmie endocarditis en orbitale cellulitis (sinaasappelhuid)2,3,4,5,6. Bovendien komen ze als oorzakelijke agens van infecties van de bloedbaan in immuungecompromitteerde, neutropenic en kankerpatiënten die chemotherapie5,7,8,9 hebben ondergaan .

De mechanismen onderliggende mitis groep pathogenese is duister, omdat enkele virulentiefactoren zijn geïdentificeerd. De mitis-groep is bekend voor de productie van H2O2, waaruit blijkt een belangrijke rol spelen in mondelinge microbiële gemeenschappen10. Meer recentelijk, verschillende studies hebben gewezen op een rol voor de H2O2 als een cytotoxin dat epitheliale cellen dood11,12 induceert. S. longontsteking, die behoort tot deze groep, is aangetoond dat het produceren van hoge niveaus van H2O2 die DNA-beschadiging en apoptosis in alveolaire cellen13induceert. Met behulp van een acute longontsteking diermodel, de dezelfde onderzoekers aangetoond dat de productie van H2O2 door de bacteriën een virulentie voordeel toekent. Studies op pneumokokken meningitis hebben ook aangetoond dat pathogen afkomstige H2O2 werkt synergetisch met pneumolysin om te activeren van neuronale cel dood14. Deze opmerkingen duidelijk vaststellen dat H2O2 geproduceerd door deze groep van bacteriën is belangrijk voor hun pathogeniteit.

Het is interessant, ook aangetoond dat leden van de mitis groep S. mitis en S. oralis leiden tot de dood van de nematode C. elegans via de productie van H2O215,16. Deze free-living nematode is gebruikt als een eenvoudige, genetisch hanteerbare model om vele biologische processen te bestuderen. Meer recentelijk, de worm heeft ontpopt als een model voor het bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties17,18. Bovendien hebben verschillende studies gewezen op het belang van het bestuderen van oxidatieve stress met behulp van dit organisme19,20,21. Zijn korte levenscyclus, mogelijkheden voor vechtpartij genen van belang door RNAi en het gebruik van groen fluorescent proteïne (GFP)-gesmolten verslaggevers om te controleren van genexpressie zijn enkele van de kenmerken die het een aantrekkelijk modelsysteem maken. Wat nog belangrijker is, zijn de trajecten die regelen van oxidatieve stress en aangeboren immuniteit in de worm zeer geconserveerd met zoogdieren20,22.

In dit protocol, wordt aangetoond hoe met C. elegans verhelderen van de pathogeniteit veroorzaakt door streptokokken afkomstige H2O2. Een gemodificeerde overleving assay wordt weergegeven, en leden van de groep mitis kunnen doden de wormen snel via de productie van H2O2. Met behulp van de leden van de mitis-groep, een duurzame biologische bron van reactieve zuurstof soorten wordt (ROS) verstrekt, in tegenstelling tot chemische bronnen die oxidatieve stress in het wormen veroorzaken. Bovendien, de bacteriën kunnen koloniseren de wormen snel, waardoor voor H2O2 rechtstreeks gericht aan de intestinale cellen (ten opzichte van andere bronnen die moeten oversteken van de verscheidene barrières). De test wordt gevalideerd of 1) door het bepalen van het voortbestaan van de gemuteerde stam van skn-1 of 2) door neerhalend skn-1 met behulp van RNAi in wormen ten opzichte van de N2 wild-type en vector controle behandeld wormen. SKN-1 is een belangrijke transcriptiefactor die de oxidatieve stressrespons in C. elegans23,24,25 regelt. Naast overleving testen, is een stam van de worm uiting van een transgene verslaggever van SKN-1B/C::GFP gebruikt om te controleren van de activering van de oxidatieve stress reactie via de productie van H2O2 door de mitis-groep.

Protocol

1. bereiding van uw platen van de Agar (Todd-Hewitt gistextract) Voeg voor 1 liter media, 30 g van Todd-Hewitt poeder, 2 g gistextract en 20 g agar aan een erlenmeyer van 2 L. 970 mL gedeïoniseerd water toevoegen aan de inhoud van de kolf en omvatten een roer-bar. Autoclaaf de media op een temperatuur van 121 ° C en een druk van 15 lb/inch2 voor 30 min. Daarna stellen de media op een bord roer en laat voor koeling met zachte roeren. Giet de media in gepaste afmetingen steriele petrischale…

Representative Results

Leden van de mitis groep S. mitis, S. oralis, en S. gordonii snel gedood de wormen, in tegenstelling tot niet-pathogene E. coli , S. mutansen S. salivarius, OP50 (Figuur 3A). De mediane overleving voor S. mitis, S. oralis, en S. gordonii was 300 minuten, 300 min en 345 min, respectievelijk. Om te bepalen als het doden was gemedieerd door H2O2</sub…

Discussion

De beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor andere pathogene bacteriën zoals Enterococcus faecium, die ook H2O2 onder anaërobe geteeld produceert of microaerophilic voorwaarden26. Typisch, voor meest pathogene organismen duurt het enkele dagen tot weken te voltooien van de tests van de overleving. Echter, als gevolg van de robuuste productie van H2O2 door leden van de groep mitis, deze tests kunnen worden voltooid binnen 5-6 uur onder d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (de Universiteit van Texas, School voor tandheelkunde), Dr. Richard Lamont (Universiteit van Louisville, de School voor tandheelkunde), en Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) voor het verstrekken van laboratorium- en klinische stammen van de mitis groep streptokokken. Wij danken ook Dr. Keith Blackwell (departement van genetica, Harvard Medical School) voor de stammen van C. elegans . Tot slot, wij danken Dr. Danielle Garsin en haar lab (de Universiteit van Texas, McGovern Medical School) voor het verstrekken van reagentia en worm stammen het onderzoek uit te voeren. Sommige stammen van worm werden verstrekt door de CGC, die wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440).

Materials

Media and chemicals
Agarose  Sigma Aldrich A9539-50G
Bacto peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt Broth Fisher Scientific DF0492-17-6
BD BBL Sheep Blood, Defibrinated   Fisher Scientific B11947
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Blood agar (TSA with Sheep Blood) Fisher Scientific R01200
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Carbenicillin Fisher Scientific BP26481
Catalase  Sigma Aldrich C1345-1G
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
IPTG Fisher Scientific MP21021012
Magnesium sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-500
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
Tetracyclin Sigma Aldrich 87128-25G
(−)-Tetramisole hydrochloride Sigma Aldrich L9756
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500 
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL Fisher Scientific 07-200-575
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm) Fisher Scientific 08-757-100A
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis  
E. coli OP50
E. coli HT115
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
N2 C. elegans wild isolate CGC
EU1 skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) CGC
LD002 IdIs1 SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) Keith Blackwell

References

  1. Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  2. Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
  3. Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
  4. Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
  5. Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
  6. van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
  7. Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
  8. Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
  9. Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
  10. Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
  11. Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
  12. Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
  13. Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
  14. Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
  15. Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
  16. Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
  17. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned–microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
  18. Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
  19. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
  20. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
  21. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, 290-301 (2015).
  22. Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
  23. Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
  24. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  25. An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
  26. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
  27. Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
  28. Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).

Play Video

Cite This Article
Naji, A., Al Hatem, A., van der Hoeven, R. Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59301, doi:10.3791/59301 (2019).

View Video