Summary

Isolation, Vermehrung und Prion-Protein-Expression während neuronaler Differenzierung von Stammzellen menschlichen Zahnpulpa

Published: March 18, 2019
doi:

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die menschlichen Dental Pulp Stammzellen isoliert und Vermehrung um das Prion-Protein-Expression bei neuronalen Differenzierungsprozess zu bewerten.

Abstract

Bioethische Fragen im Zusammenhang mit der Manipulation von embryonalen Stammzellen haben Fortschritte auf dem Gebiet der medizinischen Forschung behindert. Aus diesem Grund ist es sehr wichtig, adulten Stammzellen aus verschiedenen Geweben wie Fettgewebe, Nabelschnurblut, Knochenmark und Blut zu erhalten. Zu den möglichen Quellen ist Zahnpulpa besonders interessant, weil es einfach ist, in Bezug auf bioethische Aspekte zu erhalten. In der Tat Dental Pulp Stammzellen (hDPSCs) sind eine Art von adulten Stammzellen in neuronalen-ähnliche Zellen zu unterscheiden und kann der dritte Molar von gesunden Patienten (im Alter von 13-19) entnommen werden. Insbesondere wurde die Pulpa entfernt mit einem Bagger, in kleine Scheiben schneiden, mit Kollagenase IV behandelt und kultiviert in einem Kolben. Um die neuronale Differenzierung zu induzieren, wurden hDPSCs für 2 Wochen mit EGF/bFGF stimuliert. Bisher haben wir gezeigt, dass bei der Differenzierung der Gehalt an zellulären Prion Protein (PrPC) in hDPSCs erhöht. Die Cytofluorimetric Analyse zeigte frühen Ausdruck der PrPC , die nach neuronalen Differenzierungsprozess erhöht. Ablation von PrPC von SiRNA verhindert PrP neuronaler Differenzierung induziert durch EGF/bFGF. In diesem Beitrag zeigen wir, dass wir verstärkte Isolation, Trennung und in-vitro- Kultivierung Methoden der hDPSCs mit einige einfache Verfahren, effizientere Zellklonen erhaltenen und groß angelegte Erweiterung der mesenchymalen Stammzellen (MSCs) waren wurde beobachtet. Wir zeigen auch, wie die hDPSCs, mit Methoden, die gemäß des Protokolls erhalten sind ein ausgezeichnetes experimentelles Modell neuronaler Differenzierung der MSCs und anschließende zelluläre und molekulare Prozesse zu studieren.

Introduction

Mesenchymaler Stammzellen wurden isoliert aus verschiedenen Geweben, einschließlich Knochenmark, Nabelschnurblut, menschliche Zahnpulpa, Fettgewebe und Blut1,2,3,4,5 , 6. wie von mehreren Autoren berichtet, zeigen hDPSCs Kunststoff festhalten, eine typische Fibroblasten-ähnliche Morphologie. Diese stellen eine sehr heterogene Bevölkerung mit verschiedenen Klonen und Unterschiede in der proliferativen und differenzierenden Kapazität7,8. hDPSCs express spezifischer Marker für mesenchymale Stammzellen (d.h. CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), sie sind negativ für einige hämatopoetischen Marker (z. B. CD14 und CD19) und sind in der Lage, in-vitro-multilineage Differenzierung9, 10,11.

Mehrere Autoren haben gezeigt, dass diese Zellen in der Lage sind zu differenzieren in Neuron-wie Zellen mit verschiedenen Protokollen, die den Zusatz von NGF, bFGF, EGF in Kombination mit den spezifischen Medien und Ergänzungen7,12enthalten. Auch viele Proteine während neuronaler Differenzierungsprozess beteiligt sind, und unter diesen sind mehrere Papiere zeigen eine wichtige Rolle und Ausdruck des zellulären Prion-Proteins (PrPC), beide in embryonalen und adulten Stammzellen13, 14. PrPC stellt einen pleiotropen Molekül in der Lage verschiedene Funktionen innerhalb der Zellen als Kupfermetabolismus, Apoptose, und Widerstand gegen oxidativen stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

In unseren bisherigen Papier23untersuchten wir die Rolle von PrPC in den hDPSCs neuronalen Differenzierungsprozess. In der Tat hDPSCs express altklug PrPC und nach neuronaler Differenzierung war es möglich, eine zusätzliche Erhöhung zu beobachten. Andere Autoren die Hypothese auf einer möglichen Rolle von PrPC in neuronale Differenzierungsprozesse von Stammzellen. In der Tat treibt PrPC die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen in Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten24. Der Zweck dieser Studie war, die Methodik für die Gewinnung von Stammzellen aus Zahnpulpa, seine Differenzierungsprozess und die Rolle der PrPC während neuronaler Differenzierung zu betonen.

Protocol

Dritte Molaren, die in der Studie verwendet wurden von Patienten (13-19 Jahre alt) mit keine vorherige Erfahrung im Bereich der Drogen- oder Alkoholkonsum, alle Nichtraucher-Zimmer und mit geeigneten Mundhygiene herausgeschnitten. Am Tag der Erklärung an die Abteilung Wissenschaft Zahnheilkunde und Kieferchirurgie der Universität Rom “La Sapienza” wurde von den Patienten oder die Eltern Einwilligung eingeholt. Die Einwilligung wurde basierend auf ethischen Überlegungen und Zustimmung der Ethik-Kommission. <p class…

Representative Results

Die Isolierung und Trennung Verfahren des hDPSCs von Zahnpulpa, gewonnen aus der dritte Molar sind komplexe Prozesse, in denen kleine Veränderungen ein ruinöse Ergebnis führen kann. In diesem Papier verwenden wir das Protokoll des Arthur Et Al. 12 mit einigen Verbesserungen. Eine repräsentative Regelung der Verfahren ist in Abbildung 1dargestellt. hDPSCs stellt e…

Discussion

Dabei konzentrierten wir uns auf Methoden zur Isolierung und neuronale Differenzierung der hDPSCs; Darüber hinaus haben wir die Rolle des PrPC in diesem Prozess ausgewertet. Es gibt verschiedene Methoden, zu isolieren und hDPSCs in Neuron-wie Zellen und kritischen Schritte während des Prozesses zu unterscheiden. hDPSCs sind in der Lage, mehrere Linien wie Neuronen, Chondroblasten, Adipozyten und Osteoblasten differenzieren. In unserem Paper untersuchten wir die Mechanismen der neuronale Differenzierung und d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der “Fondazione Varrone” und Rieti Universität Hub “Sabina Universitas” zu Vincenzo Mattei unterstützt.

Abbildung 5 (A, B) abgedruckt mit freundlicher Genehmigung des Verlags Taylor & Francis Ltd aus: Rolle des Prion-Protein-EGFR multimolecular Komplex während neuronaler Differenzierung der menschlichen dental Pulp-Stammzellen. Martellucci, S., Manganelli V. C. Santacroce, Santilli F., Piccoli L., M. Sorice Mattei V. Prion. 2018 4 Mar. Taylor & Francis Ltd.

Materials

Amphotericin B solution Sigma-Aldrich A2942 It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce
Anti-B3tubulin Cell Signaling Technology  #4466 One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system
Anti-CD105  BD Biosciences 611314 Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail
Anti-CD44 Millipore CBL154-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-CD73  Cell Signaling Technology  13160 CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides
Anti-CD90 Millipore CBL415-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-GAP43  Cell Signaling Technology  #8945 Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity
Anti-mouse PE  Abcam ab7003 Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-NFH  Cell Signaling Technology  #2836 Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein
Anti-PrP mAb EP1802Y  Abcam ab52604 Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP
Anti-rabbit CY5  Abcam ab6564 Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-STRO 1 Millipore MAB4315-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
B27 Supp XF CTS Gibco by life technologies A14867-01 B-27  can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture
BD Accuri C6 flow cytometer  BD Biosciences AC6531180187 Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm)
BD Accuri C6 Software  BD Biosciences Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results
bFGF PeproThec, DBA 100-18B basic Fibroblast Growth Factor 
Centrifuge CL30R Termo fisher Scientific 11210908 it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density
CO2 Incubator 3541 Termo fisher Scientific 317527-185 it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures
Collagenase, type IV  Life Technologies 17104019 Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen
Disposable scalpel  Swann-Morton 501 It is use to cut tissues
DMEM-L Euroclone ECM0060L Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate
EGF PeproThec, DBA AF-100-15 Epidermal Growth Factor 
Fetal Bovine Serum Gibco by life technologies 10270-106 FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems
Filtropur BT50 0.2,500ml Bottle top filter Sarstedt 831,823,101 it is a device that is used for filtration of solutions
Flexitube GeneSolution for PRNP Qiagen GS5621 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Hank's solution 1x Gibco by life technologies 240200083 The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells
HiPerFect Transfection Reagent  Qiagen 301705 HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations
Neurobasal A  Gibco by life technologies 10888022 Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons 
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures
penicillin/streptomycin  Euroclone ECB3001D  It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination
Phosphate buffered saline  (PBS) Euroclone ECB4004LX10  PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range
TC-Platte 6 well, Cell+,F Sarstedt 833,920,300 It is a growth surface for adherent cells
Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap Sarstedt 833,910,302 Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag
Triton X-100  Sigma-Aldrich 9002-93-1 Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions
Trypsin-EDTA  Euroclone ECB3052D  Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface
Tube Sarstedt 62,554,502 Tube 15ml, 120x17mm, PP
VBH 36 C2 Compact Steril ST-003009000 Offers totally protection for the enviroment and worker
ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope Zeiss 3849000962 ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods.

References

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Martellucci, S., Santacroce, C., Manganelli, V., Santilli, F., Piccoli, L., Cassetta, M., Misasi, R., Sorice, M., Mattei, V. Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e59282, doi:10.3791/59282 (2019).

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