Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van een modelsysteem waarin de transcriptie van een endogene gen van belang voorwaardelijk kan worden gecontroleerd in de levende dieren of cellen met behulp van verbeterde lac -onderdrukker en/of tet activator systemen.
Hier beschrijven we een protocol voor de uitvoering van het systeem met afstandsbediening (Reversible Manipulation of TTranscription op Endogenous loci), dat voor controle van de omkeerbare en afstembare expressie van zorgt een endogene gen van belang in het leven model systemen. De afstandsbediening systeem maakt gebruik van verbeterde lac repressie en tet activeringssysteem down- of opregulatie van een target-gen binnen een enkele biologisch systeem te bereiken. Strakke repressie kan worden bereikt van onderdrukker bindend sites flexibel gelegen ver stroomafwaarts van een site start transcriptie door remming van de transcriptie rek. Robuuste opregulatie kan worden bereikt door verbetering van de transcriptie van een endogene gen door zich te richten tet transcriptionele activators aan de promotor cognaat. Dit besturingselement omkeerbaar en afstembare expressie kan worden toegepast en ingetrokken herhaaldelijk in organismen. De potentie en de veelzijdigheid van het systeem, zoals aangetoond voor de endogene Dnmt1 hier, zal toestaan nauwkeuriger in vivo functionele analyses door onderzoek van de genfunctie op verschillende niveaus van de expressie in te schakelen en door het testen van de omkeerbaarheid van een fenotype.
Genetische knock-out of transgene benaderingen zijn effectieve middelen voor het bestuderen van de genfunctie in diermodellen. Expressie verordening door deze benaderingen is echter dichotome (aan/uit), niet-stoffelijke, en dus niet in staat is van het openbaren van het volledige functionele spectrum van een gen. Voorwaardelijke Cre/LoxP technologieën hebben toegestaan spatio-temporele inactiverings- of activering van de genfunctie, maar hun dichotome natuur blijft vormen van beperkingen, zoals de cel letaliteit en onomkeerbaarheid1,2 , 3. om deze leemte opvullen, voorwaardelijke vechtpartij benaderingen zijn ontwikkeld met behulp van tet-shRNA of miRNA4geregeld. Echter, af-target effecten blijven een zorg voor RNAi5 en hebben zijn uitdagend om te bepalen van in vivo. Meer recent, CRISPR/Cas-gemedieerde transcriptionele-besturingstechnologieën hebben ingevoerd een meer veelzijdige aanpak tot zowel up- en Downregulatie van endogene genexpressie en blijk gegeven van hun hulpprogramma’s6,7 . De doeltreffendheid van de CRISPR/Cas-gemedieerde Transcriptionele controle is nog onduidelijk in vivo, en de omkeerbaarheid van KRAB gebaseerde onderdrukking blijft echter om gezien, zo sterk repressie door KRAB en haar interactie eiwit KAP1 gebleken voor het opwekken van permanente gene zwijgen8,9.
Om deze beperkingen, hebben we een nieuwe transcriptionele regelgevingssysteem kunnen voorwaardelijk regelen endogene genexpressie in een reversibele en afstembare wijze in muizen met behulp van gemanipuleerde prokaryote binaire transcriptionele toezicht-en regelgevingsstelsels10. Prokaryote binaire transcriptionele toezicht-en regelgevingsstelsels met regelgevende liganden, zoals lac en tet, dergelijke omkeerbare hebt ingeschakeld en afstembare expressie controle11,12,13, 14. echter de ontoereikende repressie potentie van de huidige binaire systemen hun brede goedkeuring voor het beheersen van de expressie van endogene genen in zoogdieren heeft belemmerd. We een verbeterde lac onderdrukking systeem voldoende krachtig voor de onderdrukking van endogene genen ontwikkeld en een nieuwe strategie van gerichte tet transcriptionele activators rechtstreeks naar de cognaat promotor van een endogene gen te bereiken in dienst robuuste opregulatie (Figuur 1)10. Met deze technologie, hebben wij bijna twee ordes van grootte expressie controle van het endogene Dnmt1 gen in een afstembare, afleidbare en omkeerbare wijze10bereikt. Hier bieden wij de stapsgewijze instructies voor de in vivo toepassing ervan op andere genen en organismen met behulp van muizen als een soort model.
Figuur 1 : Overzicht van de afstandsbediening systeem. De transcriptie van een endogene target-gen kan worden geregeld met behulp van gemanipuleerde lac -onderdrukker en tet activator systemen. De doelgroep gene promotor of intron is ontworpen om de exploitanten voor de strakke-bindende LacIGY onderdrukker en/of de rtbevatten TA-M2 activator. R geeft aan Repron (Repression introp), die 12 symmetrische lac operators (S) plus een gedeeltelijke konijn bèta-globin intron bevat. T geeft aan tet exploitant. De onderdrukker en/of activator is/van de promotor van een weefsel-specifieke worden uitgedrukt. De expressie van het target-gen kan vervolgens omkeerbaar afgestemd op het niveau van de gewenste expressie door toediening van IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, een antagonist van de onderdrukker LacIGY) of Doxycycline (Dox). Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.10Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Controleer voordat u begint met dit protocol, tabel 1 ter identificatie van de relevante stappen voor het gewenste besturingselement van genexpressie. Bijvoorbeeld, als u wilt een muis waarmee omkeerbare Downregulatie van “Gene X” ingenieur, voltooien secties 1, 3 en 4 van de onderstaande protocol. Tabel 1 bevat ook een overzicht van de benodigde componenten van het systeem van de afstandsbediening.
Gewenste expressie wijzigen | Repressie alleen | Activering alleen | Zowel de repressie en de activering |
Relevante onderdelen van het Protocol | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
Afstandsbediening volgorde nodig in Target-gen | Repron (“Repressie intron”; 12 symmetrische lac operatoren plus een gedeeltelijke konijn bèta-globin intron) | Tet exploitant(en) | Repron en Tet exploitant(en) |
Afstandsbediening reeks locatie | Intron | Promotor | Intron & promotor |
Activator/onderdrukker die nodig zijn voor het gewenste besturingselement | LacIGY onderdrukker | rtTA-M2 Activator | LacIGY onderdrukker en rtTA-M2 Activator |
Regelgevende liganden | IPTG | Doxycycline | IPTG en/of Doxycycline |
Tabel 1: Overzicht van REMOTE-control componenten.
Een kritieke stap en mogelijke beperking van het systeem van de afstandsbediening is de uitdaging die is gekoppeld aan het inbrengen van de onderdrukker en/of activator bandplaatsen zonder doel genexpressie. Onze oorspronkelijke benadering van de repressie, betrokken zoals toegepast op de Dnmt1 -gen, invoeging van lac -onderdrukker bandplaatsen in transcriptionally kritische gebieden van een promotor. Om het risico van invloed zijn op de functie van de promotor, en dus tot verbetering van de algemene toepasbaarheid van het systeem van de afstandsbediening, ontwikkelden we een repressie intron gebaseerde aanpak. De potentie van onze verbeterde lac systeem toegestaan ons te strak onderdrukken de transcriptie van de sterke initiatiefnemers we bij exploitanten gelegen getest honderden tot verscheidene kilobases stroomafwaarts van de transcriptie beginnen sites (Figuur 3A – C) 10. bovenal de niveaus van repressie waren onafhankelijk van de transcriptionele sterke punten van de initiatiefnemers (Figuur 3A – C)10. Dit suggereert dat de capaciteit van de repressie van onze intron gebaseerde onderdrukking systeem groter is dan de transcriptionele sterkte van de geteste initiatiefnemers. In deze intron gebaseerde benadering is het waarschijnlijk dat de repressie is bemiddeld door fysieke interferentie tussen twee componenten, de transcriptie rek machine en het lac repressors57. Dit eenvoudige onderdrukking mechanisme en de aangetoonde robuustheid van de intron gebaseerde methode kunnen betekenen dat deze aanpak in het algemeen regels tot verschillende genen, weefsels, en organismen.
De opregulatie door de afstandsbediening systeem vereist de transactivator bindende sequenties in de nabijheid van de target gene promotor, die dreigen van invloed zijn op de functie van de promotor. Echter vonden we dat betreffendedepositie van bindende sequenties buiten de transcriptionally kritische regio kunnen. Zowel Dnmt1 als EF1α de initiatiefnemers waren krachtig upregulated van tet exploitanten ligt een paar honderd honken stroomopwaarts van de transcriptie start sites10. Deze ontspannen beperking vermindert aanzienlijk de kans van invloed zijn op de functie van de promotor van een gen van de doelgroep in het ontbreken van de transactivator. Verhoging van het aantal bindende sequenties en/of gebruik van sterkere transactivators kon helpen verder het risico doordat opregulatie van sites verder weg van de transcriptie begin site.
Ons systeem afstandsbediening biedt elegante controle van het niveau, de timing en de locatie van de endogene genexpressie, waardoor voor het testen van de omkeerbaarheid van een fenotype en de gevolgen van andere expressie niveaus, die niet gemakkelijk haalbaar door huidige in vivo gen expressie-besturingstechnologieën. Het is belangrijk op te merken dat in de meeste gen expressie analyses, met inbegrip van onze, expressie waarden het gemiddelde van een bevolking van cellen vertegenwoordigen, waaronder aanzienlijke variatie kan worden gevonden. Deze heterogeniteit invloed kan hebben op cellulaire besluitvormingsprocessen, zoals differentiatie of apoptosis58. Hoewel de precisie van gen expressie controle kan waarschijnlijk verder worden verbeterd door extra genetische circuit engineering59, zal de waargenomen sterkte van ons huidige systeem nuttig onderzoek van de genfunctie in veel biologische contexten toestaan. Bovendien is een hoge mate van doel specificiteit verwachting vanwege de complexiteit van de sequenties die exploitant, alsmede de grote evolutionaire afstand tussen zoogdieren en de oorspronkelijke soorten de regelgevende onderdelen60. Bovendien kunnen transgene muis lijnen van repressors en activators worden ontwikkeld en werkzaam voor een endogene gen. Bestaande Muismodellen van de tet transactivator kunnen bijvoorbeeld worden aangepast opregulatie van een target-gen in de gewenste muis weefsels bereiken. Wij recent ontwikkelde een transgene lijn die robuust weefsel-specifieke uitdrukking van onze verbeterde lac-onderdrukker in meerdere weefseltypes (HLA rijden kan) in combinatie met bestaande Cre lijnen door de invoering van het lacIGY -gen in de locus Hipp11 48 onder de controle van een element van de Lox-STOP-Lox (niet uitgegeven). Deze regel zou aanzienlijk vergemakkelijken van de weefsel-specifieke toepassing van het systeem van de afstandsbediening.
Gene opregulatie door het afstandsbediening systeem biedt verschillende voordelen in vergelijking met de huidige afleidbare transgene benaderingen. Het vereist geen generatie van meerdere transgene lijnen om te testen voor de effecten van de positie van de invoegpositie, zoals het maakt gebruik van de endogene locus. Bovendien, is deze aanpak geschikt voor opregulatie van genen met sterke basislijn uitdrukking omdat het verbetert de expressie van een reeds robuuste promotor, overwegende dat conventionele transgene modellen op minimale virale initiatiefnemers vertrouwen. Tot slot, het weefsel specificiteit, celcyclus controle, egaliseren en lamineren varianten van een target-gen kunnen worden gehandhaafd op opregulatie door onze aanpak, daar het behoudt onderdelen van natuurlijke verordening zoals aangeboren cis-regelgevende elementen. De komst van CRISPR/Cas-gemedieerde gentargeting technologie zal aanzienlijk vergemakkelijken van de toepassing van deze technologie in verschillende modelsystemen.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de wijlen Dr. Heidi Scrable voor haar gulle gift van de zoogdieren lacI gene construct (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr Daniel Louvard (Institut Curie, Parijs, Frankrijk) voor het verstrekken van de promotor van de Villin, en Dr Laurie Jackson-Grusby (Children’s Hospital, Boston, MA) voor haar bijdragen aan de vroege stadia van de technologieontwikkeling van deze. We zijn dankbaar voor Dr Nancy Wu en Dr. Robert Maxson voor hun hulp bij het genereren van de transgene en knockout muizen. Wij danken de leden van de Laird laboratorium voor nuttige discussies en ondersteunen. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325 R01 CA157918 en R01 CA212374 te P.W.L. en 1F31CA213897-01A1 naar N.A.V.S].
B6C3F1/J | The Jackson Laboratory | 100010 | https://www.jax.org/strain/100010 |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP04 | http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE |
CRISPOR | Haeussler et al. 2016 | http://crispor.tefor.net/ | |
Doxycycline-Containing Mouse Diet | Envigo | Varies by concentration | https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/ |
ENCODE Database | Stanford University | https://www.encodeproject.org/ | |
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) | Addgene | 65795 | https://www.addgene.org/65795/ |
IPTG | GoldBio | I2481C | https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg |
pGL3-Basic | Promega | E1751 | https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751 |
SVM-BPfinder | Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University | http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/ | |
TiProD: Tissue specific promoter Database | Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen | http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de | |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | https://genome.ucsc.edu/ |