このプロトコルでは、生きた動物の細胞強化lacリプレッサーとテト活性化システムを使用して興味の内因性遺伝子のトランスクリプションを条件付きで制御できるモデル システムを生成するために必要な手順について説明します。
ここでリモート コントロール システム (再反転可能Manipulation of Transcription Endogenous 座) のリバーシブルと可変式制御を実装するためのプロトコルを記述します。生活の興味の内因性遺伝子モデル システムです。リモート コントロール システムでは、ダウンまたは単一の生物学的システムで標的遺伝子の発現を達成するために強化されたラック抑圧とテト活性化システムを採用しています。結合部位が柔軟に位置するリプレッサーからタイトな抑圧を実現できます転写伸長を阻害することによって転写開始部位の下流まで。堅牢なアップレギュレーションがテト同種のプロモーターの転写活性化因子をターゲットに内因性遺伝子のトランスクリプションを高めることによって得られます。この可逆と可変式コントロールが適用され生物で繰り返し撤回できます。効力と内因性Dnmt1 、ここに示されているように、システムの汎用性より正確な体内機能解析により、さまざまな表現のレベルでの遺伝子機能の調査との可逆性をテストすることによって、表現型。
遺伝子ノックアウトまたは形質は、動物モデルでの遺伝子の機能を研究する効果的な手段をされています。しかし、これらの方法による発現制御 (オン/オフ) 二分、時間的、従って遺伝子の完全な機能的なスペクトルを明らかにすることができるではないです。条件付き Cre/LoxP技術は、時空間的不活性化や遺伝子機能の活性化を許可しているが、二分本来引き続き細胞致死性と不可逆性1,2などの制限を提起,3。 この隙間を埋めるために条件付きのノックダウン アプローチはテトを使用して開発されている-shRNA や miRNA4を規制。しかし、オフターゲット効果の RNAi5への関心のまま、体内.を制御するために挑戦されています。もっと最近、CRISPR/Cas を介した転写制御技術はアップと内因性遺伝子発現のダウンレギュレーションの両方を達成するためのより柔軟なアプローチを導入し、実証のユーティリティ6,7.しかし、CRISPR/Cas を介した転写制御の有効性は、まだ体内の明確な KRAB ベース抑圧の可逆性はまだ KRAB で見たように、強い抑圧との相互作用の蛋白質 KAP1 が誘導するために示されています。永久的な遺伝子8,9を黙らせます。
新規転写制御システムの条件付きでリバーシブルの内因性遺伝子の発現を制御することができるこれらの制限に対処するために開発した、マウスを使用して可変的設計原バイナリ転写規制システム10。規制配位子、 lacとテトなどを原核生物バイナリ転写規制システムはこのような可逆を有効にしているし、可変式制御11,12,13, 14. ただし、現在のバイナリ システムの不十分な抑制効力哺乳類における内因性遺伝子の発現を制御するため、普及の妨げとなった。内在性遺伝子の抑圧の十分に強力な強化されたラック抑圧システムを開発し、達成するために内因性遺伝子の同種のプロモーターに直接テト転写活性化因子をターゲットの新たな戦略を採用堅牢なアップレギュレーション (図 1)10。この技術により、ほぼ可変、誘導、かつ可逆的な10の内因性Dnmt1遺伝子の発現制御を 2 桁を実現しました。ここでは、他の遺伝子と生物モデル種としてマウスを用いた in vivo 応用のためのステップバイ ステップの手順を提供します。
図 1: リモート コントロール システムの概要。内因性のターゲット遺伝子の転写は、設計されたラックのリプレッサーとテト活性化システムを使用して調整できます。ターゲット遺伝子プロモーターやイントロンはタイトバインディング LacIGY リプレッサーおよび/またはrtの演算子を含めるように設計されて TA M2 活性化。R では、Repron (担当者2977億 intr上)、部分的なウサギのベータ globin イントロン プラス 12 対称 lac オペレーター (S) が含まれていることを示します。T は、テトの演算子を示します。リプレッサーおよび/または活性化/組織固有のプロモーターから表現されます。ターゲット遺伝子の発現、可逆チューニングできる目的の式のレベルに IPTG (イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside、LacIGY リプレッサーの拮抗薬) またはドキシサイクリン (Dox) の管理によって。この図は、李ら10から変更されているこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
このプロトコルを開始する前に、表 1遺伝子発現の目的のコントロールの関連するステップを識別するを確認します。たとえば、”遺伝子 X”のリバーシブルのダウンレギュレーションを可能にするマウスを設計、セクション 1、3、および 4 を完了、プロトコルの下。表 1はまた、リモート コントロール システムの必要なコンポーネントをまとめたものです。
目的の式の変更 | 弾圧のみ | アクティブ化のみ | 抑圧と活性化 |
プロトコルの関連セクション | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
ターゲット遺伝子で必要なリモート制御シーケンス | Repron (「抑圧イントロン”; 12 対称 lac オペレーター プラス部分的なウサギのベータ globin イントロン) | テト オペレーター | Repron とテトのオペレーター |
リモート制御シーケンスの場所 | イントロン | プロモーター | イントロン ・ プロモーター |
目的のコントロールに必要な活性化/抑制因子 | LacIGY リプレッサー | 情報を頼むこと M2 活性化 | LacIGY リプレッサーと情報を頼むこと M2 活性化 |
規制配位子 | IPTG | ドキシサイクリン | IPTG および/またはドキシサイクリン |
表 1:リモート コントロール コンポーネントの概要します。
重要なステップとリモート コントロール システムの潜在的な制限は、ターゲット遺伝子の発現に影響を与えずにリプレッサーおよび/または活性剤結合部位のカーソルに関連付けられている課題です。抑圧の元取り組みDnmt1遺伝子に適用されるプロモーターの転写活性クリティカル領域内にあるlacリプレッサー結合部位の挿入に関与しています。プロモーターの機能に影響を与えるとこのようにリスクを軽減するためにリモート制御システムの一般的な適用性を改善し、抑圧のイントロン ・ ベースのアプローチを開発しました。強化されたラックシステムの効力では、緊密に位置する演算子でテスト我々 すべての強力なプロモーターの転写を抑制することができました転写のいくつか kilobases 下流に数百サイト (図 3A から C) を開始10します。 重要なのは、抑圧のレベルはプロモーター (図 3A から C)10の転写の強みの独立していた。これはイントロンに基づく抑圧体制の抑圧能力がテストのプロモーターの転写強度を超えることを示唆しています。このイントロン ベースのアプローチの抑圧は 2 つのコンポーネント、転写伸長機械と lac リプレッサー57との物理干渉が媒介なりそうです。この単純な抑圧のメカニズムとイントロン手法の実証の堅牢性このアプローチの異なる遺伝子、組織、および有機体に一般的に適用されるレンダリング可能性があります。
リモート コントロール システムによって発現プロモーターの機能に影響を及ぼすリスクを伴いますターゲット遺伝子のプロモーターに近接するトランス結合塩基配列が必要です。しかし、我々 は、シーケンスを結合の位置が重要な発現調節領域の外することができますを発見します。Dnmt1とEF1αプロモーターは、テト演算子から誘導位置数百塩基上流転写開始サイト10の確実だった。この制約が緩和大幅プロモーターの転写活性化の不在でターゲット遺伝子の機能に影響を及ぼす可能性が減ります。シーケンス結合数の増加および/またはより強い transactivators の使用は、転写の開始部位から離してサイトからアップレギュレーションを有効にすることによってリスクを軽減を助けることができます。
リモート管理体制レベル、タイミング、および内因性遺伝子の発現、表現型の可逆性とによって容易に達成可能ではない異なった表現のレベルの結果のテストを可能にする場所のエレガントなコントロールを提供します。現在 in vivo 遺伝子発現制御技術。私たちを含めたほとんどの遺伝子発現解析に式の値がその中ではかなりの変動を見つけることができますセルの人口の平均を表すことに注意してくださいすることが重要です。この不均一性58分化やアポトーシスなどの細胞の意思決定プロセスに影響を与える可能性があります。付加的な遺伝的回路工学59の遺伝子発現制御の精度がさらに改善される見通し、現在のシステムの観察力できるようになります遺伝子機能の役に立つ調査多くの生物学的文脈で。さらに、ターゲットの特異性の高度は規制コンポーネント60元の種と哺乳類の大規模な進化距離と同様、演算子のシーケンスの複雑さのためになっています。さらに、トランスジェニック マウス リプレッサー活性剤の行数を開発し、任意の内因性遺伝子を採用できます。たとえば、既存テト転写活性化マウス モデルは目的のマウス体内の標的遺伝子の発現を達成するために合わせることができます。我々 は最近車Hipp11軌跡48 lacIGY遺伝子導入することにより既存の Cre 線と組み合わせれば複数の組織型で私たちの強化されたラックのリプレッサーの堅牢な組織特異的発現トランスジェニック ラインを開発(未発表) Lox 停止 Lox 要素の制御の下で。この行が大幅にリモート コントロール システムの組織固有のアプリケーションを容易にします。
リモート コントロール システムによって遺伝子の発現は、現在の誘引可能な遺伝子導入アプローチと比較していくつかの利点を提供します。これは内因性の軌跡を活用して、カーソルの位置の影響をテストする複数の遺伝子組換え行の生成は必要ありません。さらに、このアプローチは強い基準式と遺伝子の発現に適してそれは、すでに強固なプロモーターから発現を高めるためし最小限のウイルス プロモーターに頼る従来のトランスジェニック モデル。最後に、組織特異性、細胞周期制御、およびターゲット遺伝子のスプライシングバリアントは保有されますアップレギュレーションに我々 のアプローチとして生来cisなど自然な規制の要素が保持されます-規制要素。CRISPR/Cas を介した遺伝子ターゲティング技術の出現は大幅多様なモデル システムでこの技術の応用を促進します。
The authors have nothing to disclose.
我々 は後半の Dr ハイジ Scrable ラッチ哺乳類遺伝子コンストラクト (メイヨー クリニック、ロチェスター、ミネソタ) の彼女の寛大な贈り物に感謝博士ダニエル Louvard (Institut キュリー、パリ、フランス) ビリン プロモーターを提供するため、Grusby-ジャクソン博士・ ローリー (こども病院、ボストン、MA) この技術開発の初期段階への彼女の貢献のため。トランスジェニック、ノックアウト マウスを生成に彼らの支援のため博士ナンシー呉と Dr ロバート Maxson 感謝しております。我々 は役に立つ議論のレアード研究室のメンバーに感謝し、サポートします。この作品は、国立衛生研究所 [R01 CA75090 R01 DA030325 R01 CA157918、P.W.L. に R01 CA212374 と N.A.V.S に 1F31CA213897 01A1] によって支えられました。
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