Summary

Mesure de cortisol à Koala (Phascolarctos cinereus) Fourrure

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

Nous présentons un protocole pour déterminer le solvant optimal d’extraction pour mesurer le cortisol de la fourrure de koala. Les solvants utilisés dans ce protocole sont le méthanol, l’éthanol et l’isopropanol. La détermination d’un solvant d’extraction optimal aidera à mesurer de façon fiable la fourrure afin de déterminer l’impact du stress chronique sur les koalas.

Abstract

Les méthodes optimales d’extraction hormonale utilisées pour mesurer le stress chez les animaux de tous les types d’échantillons ne sont pas toujours les mêmes. L’espèce marsupiale emblématique de l’Australie, le koala (Phascolarctos cinereus), fait face à une exposition prolongée aux facteurs de stress d’origine anthropique et l’évaluation du stress chronique dans les populations sauvages est urgentement justifiée. Une des façons les plus efficaces de mesurer le stress chronique est en analysant l’hormone glucocorticoïde cortisol dans les cheveux ou la fourrure, car il soutient les réponses physiologiques et comportementales. Cette étude de validation en laboratoire vise à tester les techniques actuelles pour valider une méthode optimale d’extraction hormonale à utiliser comme mesure non invasive du cortisol dans la fourrure de koala. Il est reconnu que l’utilisation de techniques non invasives pour mesurer les hormones de stress est préférée aux techniques traditionnelles et invasives en raison de leurs points de vue pratiques et éthiques idéaux. En outre, il est relativement plus facile d’acquérir de la fourrure à partir de koalas que d’acquérir des échantillons de leur sang. Cette étude a utilisé des échantillons de fourrure de koala acquis auprès de l’Hôpital Adélaïde Koala et de la faune pour exécuter un certain nombre de techniques d’extraction hormonale dans une tentative de valider une méthode optimale d’extraction de cortisol. Les résultats ont montré que le méthanol à 100 % fournissait l’extraction de solvants la plus optimale par rapport à 100 % d’éthanol ou 100 % d’isopropanol basé sur les résultats du parallélisme. En conclusion, cette méthode d’extraction de cortisol de la fourrure de koala a fourni un test non invasif fiable qui pourrait être employé pour étudier le stress chronique dans les koalas.

Introduction

Les écosystèmes australiens soutiennent la vie humaine grâce à la fourniture de services, y compris la nourriture et la fibre parmi de nombreuses autres interactions dynamiques1. Ironiquement, c’est l’activité humaine qui est le principal moteur de la perturbation de l’écosystème par le changement de biodiversité2. La fragmentation de l’habitat, connue sous le nom de processus de division de grands habitats continus en petites parcelles de terre, isolées les unes des autres, est le changement anthropique majeur de la biodiversité qui menace les écosystèmes australiens2. La fragmentation de l’habitat modifie la structure et la diversité de la composition des espèces dans une zone donnée, réduisant ainsi la superficie d’habitat nécessaire à ces espèces pour maintenir des populations viables2. Le résultat de ceci est concurrence accrue entre les espècespour les ressources comprenant la nourriture, le carburant, la fibre, et l’eau 3. La destruction des écosystèmes australiens par le changement de la biodiversité a des conséquences catastrophiques sur de nombreuses espèces indigènes australiennes1.

L’espèce marsupiale la plus emblématique d’Australie, le koala (Phascolarctos cinereus), dépend du fait que les écosystèmes australiens restent en bonne santé pour leur survie4. L’introduction de l’établissement européen a provoqué un déclin rapide des populations australiennes de koalas, car ils ont été abattus pour leurs peaux dans la poursuite du profit dans un grand commerce d’exportation5. Cette pratique a été interdite dans les années 1980 et les populations de koalas ont ensuite pu stabiliser5. Cependant, la croissance exponentielle de la population humaine a entraîné cette espèce en concurrence pour une grande partie de leur habitat, et leur survie est de nouveau menacée6. Selon l’Union internationale pour la conservation de la nature (UICN), toutes les populations de koalas australiens sont classées comme vulnérables à l’extinction avec une tendance démographique en baisse7. Cette inscription est attribuée à l’incertitude entourant les paramètres de population pertinents et à la variation marquée des tendances démographiques pour cette espèce7. En tant qu’animaux les plus emblématiques et endémiques, les koalas profitent largement à l’économie australienne grâce au tourisme (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Une estimation suggère que le tourisme lié au koala a généré environ 9 000 emplois et contribue entre 1,1 et 2,5 milliards de dollars à l’économie (NSW Office of Environment and Heritage 2018). L’élimination d’une espèce a le potentiel d’être catastrophique, et peut être vu dans le déclin constant de la faune indigène australienne6. En outre, l’économie australienne ressentira les ramifications si les populations de koalas australiens continuent de diminuer au rythme où elles sontde 6.

Il est suggéré que la prévalence de la mort et de la maladie en réponse à la fragmentation de l’habitat est le résultat du stress chronique8. Déjà, vingt-quatre espèces marsupiales ont été déclarées éteintes en Australie en raison de la fragmentation de l’habitat, avec des koalas suivant une tendance similaire8. La complexité de la fragmentation de l’habitat et des systèmes biologiques est synergique, mais peut être déballée grâce à l’analyse de la réponse au stress6. En général, toute perturbation dans un environnement naturel animal active une cascade complexe d’événements neurohormonaux, connu sous le nom de «combat ou de fuite» réponse9,10. Cette réponse au stress est un processus qui commence dans le cerveau où l’axe hypothalamique-pituitaire-surrénalien (HPA) est activé11. Un composant du cerveau appelé l’hypothalamus libère l’hormone de libération de corticotrophine (CRH), qui signale alors l’hypotuitaire antérieur pour libérer l’hormone adrénocorticotrophic (ACTH)11. Ceci stimule à son tour la sécrétion glucocorticoïde de la médulle surrénale. Le corps circule glucocorticoïdes à travers le sang, ce qui détourne le stockage du glucose du glycogène et mobilise le glucose à partir de glycogène stocké11. Cette cascade d’événements neurohormonaux est la réponse utilisée par l’animal pour faire face à des stimuli imprévisibles11. Cependant, lorsque les glucocorticoïdes sont libérés et restent élevés pendant une période prolongée, l’animal est considéré comme éprouvant un stress chronique12,13. Ce processus consiste à détourner l’énergie d’autres fonctions corporelles corporelles, car il est nécessaire pour la production continue de glucocorticoïdes13. En conséquence, le stress chronique peut interdire la croissance, la reproduction et l’immunité, tous étant des traits de forme physique clés requis pour la survie14.

La mesure de la production de glucocorticoïdes d’un animal est un indicateur courant utilisé pour déterminer si l’animal subit ou non un stress physiologique15. Pour ce faire, les glucocorticoïdes peuvent être mesurés dans le plasma sanguin, le sérum, la salive, l’urine ou les fèces16. Cependant, les preuves suggèrent que les cheveux sont un indicateur beaucoup plus efficace du stress chronique, par opposition aux16susmentionnés. C’est parce que les cheveux sont pensés pour incorporer des hormones transmissibles par le sang pendant sa phase de croissance; il est relativement stable; et tout cortisol détecté dans les cheveux reflète le stress physiologique ressenti au cours de la période de croissance des cheveux, qui peut être semaines à16mois . En outre, toute collection de cortisol doit être non invasive afin de minimiser le stress associé à la capture et la manipulation16. Cependant, tout stress ressenti au cours de cet événement n’aurait pas d’impact sur les niveaux de glucocorticoïdes dans les cheveux16. Il y a eu beaucoup d’études qui explorent la compétence d’utiliser des cheveux pour mesurer le stress à long terme dans un certain nombre d’animaux, et incluent des études sur des rennes, des ours grizzlis, des singes rhésus, des bœufs musqués, et des ours bruns17,18,, 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21. Le cortisol capillaire est habituellement extrait en lavant d’abord l’échantillon pour s’assurer que la sueur et le cortisol dérivé du sébum déposés à la surface des cheveux ne sont pas co-extraits avec du cortisol, puis pulvérisent l’échantillon dans un perle-batteur22. Après le lavage, l’échantillon doit être séché pour assurer l’évaporation complète22. Enfin, à l’aide d’un solvant, l’échantillon peut être extrait et reconstitué pour faciliter l’analyse du cortisol22. Le solvant le plus commun utilisé pour extraire le cortisol de la fourrure est le méthanol21,23; cependant, il y a quelques études qui emploient l’éthanol et l’isopropanol dans leurs techniques d’extraction de cortisol. Par exemple, une étude qui a utilisé l’éthanol a réussi à extraire le cortisol du liquide amniotique humain24. En outre, une étude qui a utilisé l’isopropanol a été couronnée de succès pour extraire le cortisol des cheveux humains et les ongles25,26. Pour cette raison, cette étude a testé les trois solvants (méthanol, éthanol et isopropanol) pour déterminer lequel était le plus réussi pour l’extraction du cortisol à partir d’échantillons de fourrure de koala.

L’objectif principal de cette étude était d’utiliser les techniques actuelles pour valider une technique optimale d’extraction d’hormones à utiliser comme mesure non invasive du cortisol de la fourrure de koala. Ceci a été réalisé en testant trois solvants d’extraction (méthanol, éthanol, et isopropanol). Nous avons émis l’hypothèse que le méthanol sera le solvant optimal utilisé pour extraire le cortisol de la fourrure de koala parce que c’est le solvant recommandé de l’extraction par arbor estocurant kits de cortisol27.

Protocol

Ce projet a été réalisé selon des directives strictes en matière de soins aux animaux et aux humains. L’éthique animale a été accordée par l’Université Western Sydney (A12373). De plus, une évaluation des risques en laboratoire et une forme de biosécurité et de rayonnement ont été soumises et acceptées par l’Université Western Sydney pour entreprendre cette recherche en toute sécurité (B12366). REMARQUE : Des échantillons de fourrure de koala pour ce projet ont été obtenu…

Representative Results

La détection d’analyse des métabolites d’hormone d’intérêt est déterminée utilisant le parallélisme. À l’aide d’une courbe de parallélisme, le point de liaison de 50 % détermine également le facteur de dilution de l’échantillon sur la courbe standard (Figure 1). Comme le montre le graphique du parallélisme (Figure 1), les extraits d’éthanol à 100 % et d’Isopropanol à 100 % n’ont pas fourni de déplacement parallèle par rapport à la norme du cortisol. Cependant, l’extrai…

Discussion

Il existe un certain nombre d’études qui utilisent une gamme de techniques pour détecter le cortisol dans la fourrure de mammifères. Cette étude présente des résultats pour la détection du cortisol dans la fourrure recueillie à partir d’un koala sauvage exposé au stress anthropique actuel. Cette étude révolutionnaire a utilisé la fourrure pour tester lequel des trois solvants couramment utilisés sont les meilleurs pour extraire le cortisol, une mesure du stress chronique, de la fourrure de koala. Les résult…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le financement de la recherche de démarrage pour Edward Narayan par l’Université western Sydney, School of Science and Health. Les auteurs remercient Jack Nakhoul pour son aide dans le traitement des échantillons.

Materials

Centrifuge Tubes n/a n/a 1.5 mL
Chrome Steel Beads n/a n/a 3.2 mm x 3
Cortisol Kit Arbor Assays K003-H1W Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit Arbor Assays K003-H5 Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol n/a n/a HPLC Grade
Isopropanol n/a n/a HPLC Grade
Methanol n/a n/a HPLC Grade
Micro Pipette n/a n/a n/a
Micro Precision Sieve n/a n/a 0.5 mm
Microplate Reader Bio Radi n/a n/a
Microplate Washer Bio Radi n/a n/a
Orbital Shaker Bio Line n/a n/a
Plastic Weighing Boat n/a n/a n/a
Plate Sealer n/a n/a n/a
Precision Balance n/a n/a n/a
Vortex Mixer Eppendorf n/a n/a

References

  1. Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
  2. Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
  3. Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World’s Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
  4. MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
  5. Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
  6. Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
  7. Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
  8. Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
  9. Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
  10. Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
  11. Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
  12. McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
  13. Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
  14. Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
  15. Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
  16. Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
  17. Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
  18. Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
  19. Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
  20. Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
  21. Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
  22. Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
  23. Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
  24. Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
  25. Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
  26. Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
  27. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
  28. Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).

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Charalambous, R., Narayan, E. Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur. J. Vis. Exp. (150), e59216, doi:10.3791/59216 (2019).

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