Summary

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Published: February 15, 2019
doi:

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll um Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in Maiskörner mit dem Ausdruck einer antimykotischen Proteins zu analysieren.  Mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung überwacht wir die Infektion und die Ausbreitung des Pilzes in Reife Kerne in Echtzeit. Der Test ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar.

Abstract

Aflatoxinkontamination in Nahrungs-und Futtermitteln ist eine große Herausforderung weltweit. Aflatoxine, produziert durch den Pilz Aspergillus Flavus (A. Flavus) sind potente Karzinogene, die Ernte Wert in Mais und andere Öl reiche Ernten wie Erdnuss neben posieren ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit erheblich reduzieren. Unterschiedliche Ansätze, einschließlich der klassischen Züchtung, transgene Ausdruck von Widerstand verbunden sind Proteine und RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Host-induzierte Gen-silencing von kritischen A. Flavus gen Ziele werden ausgewertet, um zu erhöhen Aflatoxin Widerstand in anfälligen Pflanzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in der Pathogenese und Aflatoxin Produktion A. Flavus , schlägt dieses Gen/Enzym α-Amylase ist ein potenzielles Ziel, A. Flavus Wachstum und Aflatoxin-Produktion zu reduzieren. In diesem Zusammenhang wurde die aktuelle Studie durchgeführt, um heterologen Expression (unter Kontrolle der konstitutiven CaMV 35 s -Promoter) eines Lablab Purpureus L. α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) im Mais gegen A. Flavusbewerten. AILP ist ein 36-kDa-Protein, das ist ein kompetitiver Inhibitor des Enzyms A. Flavus α-Amylase und gehört zur Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor Protein gemeinsam Bohne. In-vitro-Studien vor der aktuellen Arbeit hatte die Rolle des AILP bei der Hemmung von A. Flavus α-Amylase-Aktivität und Pilzwachstum gezeigt. Pilzwachstum und Aflatoxin-Produktion in Reife Kerne wurden mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung in Echtzeit überwacht. Dieser Kernel screening Assay (KSA) ist sehr einfach einzurichten und bietet zuverlässige und reproduzierbare Daten auf Infektion und das Ausmaß der Ausbreitung, die quantifiziert werden konnte zur Beurteilung von Genetik und transgenen Linien. Die Fluoreszenz von den Strapazen der GFP ist eng korreliert, pilzartige Wachstum und durch Verlängerung, es ist gut für Aflatoxin-Werte korrelierten.  Das Ziel der aktuellen Arbeit war, dieses Vorwissen in ein kommerziell wichtigen Getreide wie Mais, Aflatoxin Widerstand erhöhen zu implementieren. Unsere Ergebnisse zeigen eine Ermäßigung von 35 % – 72 % A. Flavus Anstieg AILP exprimierenden transgener Maiskörner, die wiederum in einer 62 bis 88 % Verringerung Aflatoxin übersetzt.

Introduction

Mykotoxinbelastungen durch die Pilz-Gattungen, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumund Alternaria ist ein großes Problem der Lebensmittel und Futtermittel angebauten weltweit1,2,3. Unter diesen phytopathogenen Pilzen hat Aspergillus die höchsten negative Auswirkungen auf die Ernte Wert und die Gesundheit von Mensch und Tier. Aspergillus flavus (A. Flavus) ist eine opportunistische Pflanze-Erreger, die infiziert Öl reichen Ernten wie Mais, Baumwollsaat und Erdnuss und produziert die potente Karzinogene, Aflatoxine, sowie zahlreiche giftige sekundäre Pflanzenstoffe (SMs). Mais ist ein wichtiges Nahrungsmittel und Futtermittel weltweit angebaut und ist sehr anfällig für Verunreinigungen durch A. Flavus. Die wirtschaftliche Auswirkungen einer Aflatoxinkontamination auf verliert und Minderwert bei Mais kann so viel wie $ 686,6 Millionen/Jahr in den USA2 mit prognostizierten Veränderungen des globalen Klimas, die Auswirkungen von Aflatoxinen kann dazu führen, dass größere wirtschaftliche Verluste in Mais mit Schätzungen so hoch wie $ 1,68 Milliarden/Jahr in die nahe Zukunft2. Angesichts der wirtschaftlichen und gesundheitlichen Beeinträchtigungen von Aflatoxinen in Mensch und Tier, möglicherweise vor der Ernte Aflatoxin Kontrolle im Mais der effizienteste Weg zur Verhinderung von Aflatoxinkontamination in Lebensmitteln und Futtermitteln.

Die großen vor der Ernte Kontrollansatz für Aflatoxin Widerstand in Mais, der in den letzten Jahrzehnten eingesetzt hat ist in erster Linie durch Züchtung, die eine erhebliche Menge an Zeit4erfordert. Vor kurzem hatte Biocontrol einige Erfolge bei der Reduzierung der Aflatoxin in groß angelegte Feld Anwendungen5,6. Neben Biocontrol hatte Anwendung modernster molekularer Tools wie z. B. “Host induzierte Gen-Silencing” (HIGS) durch RNAi und transgene Ausdruck des Widerstands-assoziierte Proteine einige Erfolge bei der Reduzierung von A. Flavus Wachstum und aflatoxin Produktion in kleinem Maßstab Labor- und Studien. Diese Ansätze werden derzeit neben der Identifizierung von neuen potenziellen A. Flavus gen Zielen für zukünftige Manipulation optimiert.

Neben Gene, die Mykotoxinproduktion als potentielle Ziele von transgenen Kontrollstrategien direkt beteiligt sind, haben Pilze Amylasen gezeigt worden, um eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pathogenese und Mykotoxin-Erfolgsproduktion in frühen Phasen der Host-Pflanze-Infektion. Ein paar Beispiele Pythium Pleroticum (kausaler Agent Ingwer Rhizom Fäulnis), Fusarium Solani (kausaler Agent der Blumenkohl willst), wo positive Korrelationen zwischen Pathogenität und α-Amylase Expression und Aktivität beobachtet 7,8. Hemmung der α-Amylase-Aktivität durch gen-Knockout oder Knockdown Ansätze wirkt sich negativ auf Pilz Wachstum und Toxin-Produktion. Ein α-Amylase-Ko-Mutante von A. Flavus konnte Aflatoxine wenn auf Stärke Substrat oder entkeimten Maiskörner9gewachsen zu produzieren. In Fusarium Verticillioides , keine α-Amylase Ko-Belastung während der Infektion von Maiskörnern10Fumonisin B1 (Mykotoxine) produzieren. In einer neueren Studie Gilbert Et Al. (2018) gezeigt, dass ein RNAi-basierten Knock down- A. Flavus α-Amylase Ausdrucksformen durch HIGS A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion11 deutlich reduziert .

Spezifische Inhibitoren der α-Amylase-Aktivität haben auch ähnliche Ergebnisse produziert, wie Down-Regulierung der α-Amylase Ausdruck entnommen. Der erste Bericht über die Rolle der ein α-Amylase-Inhibitor in Pilzresistenz kamen aus der Isolierung und Charakterisierung von einer 14-kDa-Trypsin-α-Amylase-Inhibitor von Maislinien resistent gegen A. Flavus12. Weitere screening von mehreren hundert Pflanzenarten Fakhoury und Woloshuk führten zur Identifizierung eines 36-kDa α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) aus den Samen der Hyazinthe Bohnen, Lablab Purpureus L.13. Der Peptidsequenz AILP glich Lektine aus der Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor berichtet gemeinsam Bohne14,15. Gereinigten AILP wird keine hemmende Aktivität gegenüber Säugetieren Trypsin und weitere in-vitro Charakterisierung zeigte deutliche Hemmung der A. Flavus Wachstum und conidial Keimung13aufweisen. Die Berichte hier eindeutig zeigt α-Amylase kann dienen als Target in der Steuerung Ansätze beschränken, Krankheitserreger oder Schädlinge, die abhängig von Stärke Mobilisierung (durch α-Amylase-Aktivität) und Erwerb der lösliche Zucker als Energiequelle während ihrer Pathogene Interaktion mit Wirtspflanzen.

Alpha-Amylase ist bekannt, dass kritische A. Flavus Pathogenität9,10,11, und angesichts der Bedeutung der AILP als ein potenter Anti-A. Flavus Agent (α-Amylase Hemmung/Antigrowth)13, Wir generierten transgene Maispflanzen mit dem Ausdruck Lablab AILP gen unter der konstitutiven CaMV-35 s-Promoter. Ziel war es zu untersuchen, ob heterologen Expression von dieser α-Amylase-Inhibitor in Mais gegen A. Flavus Pathogenese und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion wirksam ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass transgene Maiskörner mit dem Ausdruck AILP deutlich A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während der Kernel-Infektion reduziert.

Protocol

(1) Plasmid Konstrukte und Mais transformation PCR verstärkt Lablab AILP mithilfe der Primer 5′-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 ‘und 5’-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3″einfügen. Die PCR-Bedingungen umfassen einen anfängliche Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 30 s (Schritt 1), gefolgt von Denaturierung bei 98 ° C für 10 s (Schritt 2), Glühen bei 55 ° C für 30 s (Schritt 3), Dehnung bei 72 ° C für 20 s (Schritt 4), 31 Zyklen von Schritt 2 zu Schritt 4 , und eine endgültige Dehnung Schri…

Representative Results

Mais-Transformation und molekulare Screening von transgenen Pflanzen Unreife Embryonen Hi-II-Maislinien verwandelten sich mit Agrobacterium Tumefaciens EHA101 Stamm, enthält die letzte Pflanze Ziel Vektor mit dem Ausdruck der Lablab Purpureus AILP gen unter der Kontrolle des CaMV- 35 s Promotor. Fünf unabhängig transformierte Maislinien wurden an die T6-Generation für nach…

Discussion

Ertragsverluste bei landwirtschaftlichen Nutzpflanzen durch Erreger und Schädlinge ist ein globales Problem-20. Derzeit, Anwendung von synthetischen Fungiziden und Pestiziden ist das vorherrschende Mittel für steuernde Anlage Krankheitserreger und Schädlinge, aber passives Toxizität von diesen Biochemikalien in Lebens- und Futtermitteln kann ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit21darstellen. Angesichts der wirtschaftlichen Bedeutung der Mais…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken David Meints, University of Arkansas für seine Hilfe bei der Entwicklung und Analyse von transgenem Mais während der frühen Generationen. Diese Arbeit erhielt die finanzielle Unterstützung des USDA-ARS CRIS-Projekts 6054-42000-025-00D. Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in diesem Artikel wird ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA-ARS gleicher Beschäftigung Gelegenheit (EEO) Politik Mandate Chancengleichheit für alle Personen und verbietet Diskriminierung in allen Aspekten der Agentur Personalpolitik, Methoden und Erfahrungen.

Materials

Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

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Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

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