Summary

Isolement et transfert adoptif de sel élevé traités des cellules dendritiques présentatrices d’antigène

Published: March 05, 2019
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules dendritiques des rates murins de tri cellulaire magnétique et transfert adoptif en souris naïves de. Le modèle de cellules dendritiques activées de haut-sel a été choisi pour expliquer la procédure étape par étape de transfert adoptif et cytométrie en flux.

Abstract

La prise excessive de sel alimentaire contribue à l’inflammation et joue un rôle essentiel dans le développement de l’hypertension. Précédemment, nous avons constaté que les cellules dendritiques présentatrices d’antigènes (CD) sent élevées de sodium extracellulaire conduisant à l’activation de la NADPH oxydase et la formation d’isolevuglandin (IsoLG)-protéines adduits. Ces IsoLG-protéines adduits réagissent avec le self-protéines et promouvoir un état autoimmun-like et hypertension. Nous avons développé et optimisé state-of-the-art des méthodes pour étudier la fonction DC dans l’hypertension. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement, dans vitro traitement avec sodium élevé et transfert adoptif de murin CD11c splénique+ des cellules dans des souris destinataires afin d’étudier leur rôle dans l’hypertension.

Introduction

Excès de sel alimentaire est un facteur de risque majeur pour l’hypertension. 1 , 2 the American Heart Association recommande un maximum de 2 300 milligrammes (mg) de l’apport en sodium (Na+) par jour, cependant ; moins de 10 % de la population américaine observe cette recommandation. 3 , 4 réduction modeste apport Na+ abaisser la pression artérielle et réduire les nouveaux cas annuels de cardiopathies coronariennes et des accidents vasculaires cérébraux aux Etats-Unis de 20 %. 5 un problème majeur avec la consommation excessive de sel est que 50 % de la population hypertendue présente une sensibilité au sel, définie comme une augmentation de 10 mmHg de la tension artérielle après chargement Na+ ou une baisse similaire dans la tension artérielle après Na+ restriction et la diurèse. 6 sensibilité au sel également survient chez 25 % des individus normotendus et est un facteur prédictif indépendant de décès et d’accidents cardiovasculaires. 7 , 8 mécanismes de détection de sel dans l’hypertension impliquant le rein ont été abondamment étudiées ; Toutefois, des études récentes suggèrent que les cellules immunitaires peuvent détecter Na+. 9 , 10

Récentes indiquent que les changements rénaux Na+ de manutention peuvent causer une accumulation de Na+ dans l’interstitium et promouvoir l’inflammation. 11 , 12 notre laboratoire et autres ont montré que les cellules du système immunitaire inné et adaptatif de contribuent à l’aggravation de l’hypertension. 9 , 13 , 14 , 15 divers stimuli hypertensifs, y compris l’angiotensine II, la norépinéphrine et sel cause macrophages, monocytes et lymphocytes T à s’infiltrer dans le rein et le système vasculaire et favorisent la rétention de Na+ , vasoconstriction, la pression artérielle élévation et dommages d’extrémité-organe. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 dans les études antérieures, nous avons constaté que les contrôleurs de domaine s’accumulent isolevuglandin (IsoLG)-protéines adduits en réponse à divers stimuli hypertensifs, y compris l’angiotensine II et DOCA-sel de l’hypertension. 14 IsoLGs sont des produits hautement réactives de la peroxydation lipidique qui rapidement et de façon covalente adduit de lysines des protéines et leur accumulation est associée à l’activation de DC. Formation en murin DCs.9 entrée Na+ dans DCs est médiée par l’amiloride sensible transporteurs d’adduits 14 nous avons récemment créé qu’élevée Na+ est un puissant stimulus pour IsoLG-protéine. Na+ est ensuite échangée pour le calcium (Ca2 +) par l’intermédiaire de l’échangeur2 + /nom de Na+. Ca2 + active la protéine kinase C (PKC) qui active la NADPH oxydase, conduisant à une augmentation superoxyde (O2· –) et la formation d’un adduit IsoLG-protéine. 9 transfert adoptif de sel-exposés l’hypertension DCs nombres premiers en réponse à une dose sous presseur d’angiotensine II. 9

Identification des CD11c+ DCs de tissus a été précédemment limité à l’immunohistochimie et la RT-PCR, et isolement des contrôleurs de domaine a été limitée à la cellule tri par cytométrie en flux. Même si écoulement cytometry cellule tri est une méthode puissante pour l’isolement des cellules immunitaires, il est coûteux et fastidieux et conduit à un rendement faible de cellules viables. Par conséquent, nous avons optimisé un protocole étape par étape pour la digestion des tissus, stimulation in vitro et transfert adoptif de CD11c+ DCs pour étudier l’hypertension.

Protocol

De l’Université Vanderbilt animalier institutionnel et Comité d’urbanisme ont approuvé les procédures décrites dans les présentes. Souris sont logés et pris en charge conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (National Academies Press. Révisée en 2010). 1. isolement des rates de souris Préparer le RPMI 1640 : 10 % FBS, 0,10 mM HEPES, pyruvate de sodium 1 mM, 50 µM β-mercaptoéthanol et 1 % la pénicilline/streptomycine. <…

Representative Results

La figure 1 représente une représentation schématique des étapes décrites ci-dessus. Spleens murins isolés sont triés pour CD11c+ DCs par cellule magnétique, tri et plaqué dans les médias sels normales (NS ; 150 mmol de NaCl) ou forte media sel (HS ; 190 mmol NaCl) pendant 48 h. CD11c+ DCs moutschen acheminés par rétro-orbitaire injection pour les bénéficiaires souris naïves. Dix jours plus tard, les souris sont implant?…

Discussion

Dans le protocole actuel, nous avons optimisé les procédures pour isoler CD11c+ DCs des rates de souris et moutschen de transférer dans des animaux naïfs pour étudier le rôle des contrôleurs de domaine dans l’hypertension induite par le sel. Ce protocole peut être adapté pour isoler et transfert moutschen autres sous-ensembles de cellules immunitaires, dont les macrophages, les monocytes et les cellules immunitaires adaptatives dont les lymphocytes T et B. Nous avons optimisé le processus de digest…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par American Heart Association accorde POST290900 à N.R.B., 17SDG33670829 L.X. et les National Institutes of Health accorder K01HL130497 à A.K.

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c Biolegend 117324
autoMACS Running Buffer  Miltenyi Biotec 130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure  Miltenyi Biotec 130-108-338
Collagenase D Roche 11088866001
DNase I Roche 10104159001
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec  130-092-575
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
GentleMACS C tube Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Invitrogen L34964
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACs Seperator  Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 medium  Gibco 11835-030

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Cite This Article
Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (145), e59124, doi:10.3791/59124 (2019).

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