Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Da allora di Origine delle speciedi Darwin¹, gli scienziati hanno acquisito profonde intuizioni come tratti sono modellati evolutivamente in risposta a pressioni ambientali ed ecologiche definite, grazie alla grotta organismi². Il tetra messicano, a. mexicanus, consiste di eyed popolazioni ‘superficie’ ancestrale che popolano fiumi tutto il Messico e il Texas del sud e di almeno 29 popolazioni geograficamente isolate di morph grotta derivata che abitano la Sierra del Abra e altre zone del Messico nord-orientale³. Un numero di tratti di grotta-collegati è stato identificato in a. mexicanus, compreso consumo di ossigeno alterata, depigmentazione, perdita degli occhi e alterata alimentazione e foraggiamento comportamento^{4,5,6, 7,8,9}. A. mexicanus presenta un potente modello per studiare i meccanismi di evoluzione convergente a causa di una ben definita storia evolutiva, una dettagliata caratterizzazione dell’ambiente ecologico e la presenza di indipendentemente evoluto grotta popolazioni^10,11. Molti dei tratti grotta-derivati che sono presenti nella caverna, compresa la perdita dell’occhio, perdita di sonno, alimentazione, perdita di scolarizzazione è aumentato, ridotto di aggressione e ridotto le risposte allo stress, più volte si sono evoluti attraverso origini indipendenti, spesso utilizzando diverse vie genetiche tra grotte^{8,12,13,14,15}. Questo ripetuto evolution è un aspetto potente del sistema a. mexicanus e può fornire spaccato la questione più generale dei sistemi genetici come può essere perturbato per generare fenotipi simili.

Mentre l’applicazione della tecnologia genetica per l’indagine meccanicistica della funzione del gene è stato limitato in molte specie di pesci (tra cui a. mexicanus), gli avanzamenti recenti in zebrafish forniscono una base per lo sviluppo della tecnologia genetica nei pesci ¹⁶,¹⁷,¹⁸,^19,20. Numerosi strumenti sono ampiamente utilizzati in zebrafish per manipolare l’espressione genica e l’attuazione di queste procedure a lungo sono stati standardizzati. Ad esempio, l’iniezione di morpholino oligos (MOs) a livello di singola cellula selettivamente blocca RNA e impedisce la traduzione per una breve finestra temporale durante sviluppo^21,22. Inoltre, modifica del gene approcci, come cluster regolarmente intervallate brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR-collegato della proteina 9 (Cas9) e nucleasi di trascrizione attivatore-come effettore (TALEN), consentire per la generazione delle omissioni definite o, in alcuni casi, gli inserimenti attraverso una ricombinazione in genomi^19,20,23,24. Transgenesi sono utilizzata per modificare l’espressione genica stabile o funzione in un modo specifico di cellula-tipo. Il sistema Tol2 viene utilizzato efficacemente per generare animali transgenici di pre transposase mRNA con un plasmide DNA Tol2 contenente un transgene^25,26. Il sistema Tol2 utilizza la transposase Tol2 di medaka per generare gli inserimenti di germline stabile di transgenici construct17. Generazione di Tol2 transgenetica coinvolge pre un plasmide contenente un transgene affiancato da siti di integrazione Tol2 e mRNA per Tol2 transposase¹⁷. Questo sistema è stato utilizzato per generare una matrice di linee transgeniche in zebrafish e il suo utilizzo ha recentemente ampliato ai sistemi modello emergente addizionali, tra cui ciclidi, killifish, spinarello e, più recentemente, la caverna messicano^{27, 28},²⁹,³⁰.

Mentre la caverna è un affascinante sistema biologico per meccanismi di comprensione dell’evoluzione del tratto, sua piena capacità come un modello evolutivo non è stata pienamente sfruttata. Ciò è parzialmente dovuto un’incapacità di manipolazione genetica e cellulare direttamente funzionare³¹. Geni candidati tratti complessi di regolazione sono stati identificati usando quantitative trait loci (QTL) gli studi, ma la convalida di questi geni candidati è stato difficile³²,^33,34. Recentemente, transitoria atterramento utilizzando morpholinos, gene editing utilizzando sistemi CRISPR e TALEN e l’uso di Tol2-transgenesi mediate sono stati usati per studiare le basi genetiche alla base di un numero di tratti³⁵,³⁶,³⁷ ,³⁸. L’implementazione e la standardizzazione di queste tecniche vi permetterà per le manipolazioni che interrogano le basi molecolari e neurali di tratti biologici, tra cui la manipolazione della funzione genica, l’etichettatura delle popolazioni di cellule definito, e l’espressione dei reporter funzionale. Considerando che l’efficace attuazione di questi strumenti genetici per manipolare gene o funzione cellulare è stata dimostrata in sistemi modello emergente, protocolli dettagliati sono ancora carenti in a. mexicanus.

A. mexicanus forniscono approfondimenti critici i meccanismi dell’evoluzione in risposta ai cambiamenti ambientali e presentare l’opportunità di identificare nuovi geni che regolano diversi tratti. Una serie di fattori suggeriscono che a. mexicanus è un modello estremamente trattabile per l’applicazione degli strumenti genomici stabiliti attualmente disponibile in modelli genetici consolidati, tra cui la possibilità di mantenere facilmente il pesce nei laboratori di grandi dimensioni di covata, trasparenza, un genoma sequenziato e analisi comportamentali definiti³⁹. Qui, descriviamo una metodologia per l’uso di morpholinos, transgenesi e gene editing in superficie e Grotta di popolazioni di a. mexicanus. La più ampia applicazione di questi strumenti in a. mexicanus consentirà un’indagine meccanicistica di processi molecolari che sono alla base dell’evoluzione delle differenze inerenti allo sviluppo, fisiologiche e comportamentali tra caverna e pesci di superficie.