Summary

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

Published: February 21, 2019
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Summary

このプロトコルの目的は、ラベル、豊かにする、および特定蛋白質キナーゼ CK2 細胞ライセートや組織ホモジネートなど複雑な生物的サンプルからの基板です。このメソッドは、この目的のため CK2 生物のユニークな側面を活用しています。

Abstract

キナーゼ基質の関係の研究は生理と病態におけるこれらの酵素とその下流の機能の完全な理解を得るために不可欠です。CK2 は複数の細胞プロセスに関与する基板の何百もの成長のリストに進化上保存されたセリン/スレオニン キナーゼです。その多面プロパティのため抽出と定量化 CK2 基板の包括的なセットは特に挑戦されているし、この重要な酵素の研究でハードルのまま。このような課題に対処するため、我々 は、ターゲットの濃縮と推定 CK2 基板の識別を可能にする汎用性の高い実験的戦略を考案した.このプロトコルは、ライセートその基質細胞または組織の特定の thiophosphorylation を可能にする CK2 のユニークな二重共同基質特異性の活用します。これらの基質タンパク質がその後は、アルキル化、沈澱と液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (MS/LCMS) によって識別されます。我々 はショウジョウバエ卵巣から CK2 基板を正しく識別するこのアプローチを使用している以前とここで我々 は調査方法の適応性を示すひと膠芽腫細胞にこのプロトコルのアプリケーションを拡張、各種のモデル生物・実験システムにおけるこのキナーゼの生物学的役割は。

Introduction

蛋白質キナーゼはシグナル伝達カスケードの主要なコンポーネントです。これらの酵素による基質タンパク質のリン酸化は細胞分裂、新陳代謝および他の中の分化を制御する重要なイベントを調節する生体反応を引き出します。CK2 は普遍的表現、好酸性セリン/スレオニン ・ キナーゼ人間に酵母から保存されているが、転写制御からアポトーシス1 細胞周期の進行に至るまで多くの細胞プロセスで重要な役割を果たしています。、2,3。酵素は 2 つの触媒 α で構成される heterotetramer (または α’) サブユニットと 2 つの規制 β サブユニット4。高い, だけでなく、CK2 の特徴 2 他珍しいその分析を複雑にするすなわち、構成活動5と二重共同の基質特異性6。この後者のプロパティは、基質タンパク質のリン酸化のため ATP と同様に GTP を使用する能力を持つ CK2 を与えます。

マウス CK2 の触媒作用または規制のサブユニットの遺伝子の欠失は、開発と器官形成78時に重要な役割を果たしていることを示す胚性致死の結果します。CK2 は癌のいくつかの種類の過剰発現も、従って有望な治療上のターゲット9,10,11を表します。確かに、特異的阻害剤そのターゲット CK2 キナーゼ活動現在調査中ですこの目的12,13,14。一方、CK2 の阻害は, 本来の代わりを与え、可能なオプションと、おそらくより合理的なアプローチはある特定の癌の進行の根底にある重要な CK2 基板を対象とするでしょう。したがって、包括的な同定と CK2 基質タンパク質の機能解析は特定の組織や腫瘍の型の中でこのキナーゼの特定の機能を解明するための重要な利点のでしょう。

ここでは、細胞や組織ライセートなど複雑な生体試料から CK2 基板を識別するため多彩な生化学的手法について述べる。このプロトコルを用いて GTP アナログ GTPγS (その他の内因性のキナーゼを使用ことはできませんグアノシン 5′-[γ-thio]triphosphate) CK2 のデュアルの共同の基質特異性の活用します。これにより、このサンプルに後続の分離と同定のための基板を「ラベル」としてキナーゼ。

Protocol

メモ: は、必要な材料は、使用可能な適切に準備を確認 (材料の表を参照してください)。 1. 準備 機械的に組織サンプル (表 1の換散バッファーの 100 μ L の組織の 1-2 mg) を溶解または培養細胞 (換散バッファーの 350 μ L で 80-90% の合流は、10 cm プレート)、実験用サンプルの 900 μ L の合計を収集することを目標とします。このボリュームは、…

Representative Results

図 1に実験手順の概略図があります。技術の基盤には、リン酸化グループ転送に GTP を使用する CK2 の珍しい機能です。ホロ酵素 CK2 外因性内因性 CK2 基板の thiophosphorylation の細胞ライセート結果 GTP アナログ、GTPγS、に沿っての追加。ライセート アルキル化試薬p- ニトロベンジル イマチニブ (PNBM) との後の治療はエステル抗 thiophosphate 抗体…

Discussion

ここでは、複雑な生物的サンプルからの蛋白質キナーゼ CK2 の基板を識別するため比較的単純な生化学的手法について述べる。このプロトコルの重要なステップは、CK2 の異常な酵素学的性質に基づくし、CK2 依存 thiophosphorylation GTPγS 以降免疫沈降と識別を用いた特異的基質タンパク質が含まれています。これらの結果、ひと神経膠芽腫細胞、ショウジョウバエ卵巣18…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、授業を実施するペンシルベニア州保健省から連邦普遍的な研究強化助成金によって部分で支えられました

Materials

12 mg/mL PNBM Abcam ab138910 40.5 µL
2.5 mM GTPγS Sigma-Aldrich G8634-1MG 5.4 µL
Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-373894 1:1000 for Western blotting
Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-32233 1:1000 for Western blotting
Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody Abcam ab22758 1:1000 for Western blotting
Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody Abcam ab92570 Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
Centrifuge pre-set to 4ºC ThermoScientific Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 
cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor Roche 11836170001
Lysis Buffer See recipe below See recipe below 30 mL
Normal rabbit IgG antibody (isotype control) Cell Signaling Technology 2729S  Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
PD MiniTrap Column GE Healthcare 28-9180-10 3 columns
Protein A/G Plus Agarose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003 600 µL
Recombinant human CK2 holoenzyme New England Biolabs P6010S 2.7 µL
Rotator Labnet: Mini Labroller Mini Labroller SKU# H5500
T98G human glioblastoma cells ATCC CRL-1690
Water bath pre-set to 30ºC Shel Lab H20 Bath Series Model# SWB15

References

  1. Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
  2. Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
  3. Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
  4. Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
  5. Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
  6. Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
  7. Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
  8. Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
  9. Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
  10. Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
  11. Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
  12. Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. 암 연구학. 70 (24), 10288-10298 (2010).
  13. Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
  14. Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
  15. Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
  16. Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
  17. Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
  18. McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
  19. Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
  20. Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
  21. Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
  22. Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
  23. Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).

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Cite This Article
Chojnowski, J. E., McMillan, E. A., Strochlic, T. I. Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach. J. Vis. Exp. (144), e59037, doi:10.3791/59037 (2019).

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