Burada, otomatik tarama ve veri toplama seçenekleri kullanılabilir bazı sinkrotron beamlines nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bilim adamları göndermek cryocooled örnekleri sinkrotron için ve kırınım özellikleri ekranlı, veri kümeleri toplanan ve işlenmiş ve, mümkün olan yerlerde, bir yapı çözüm yürütülen — tüm insan müdahalesi olmadan.
Yüksek-parlaklık röntgen ışınları otomasyon ile birleştiğinde Yapısal Biyoloji bile en zorlu projelerde sinkrotron tabanlı makromoleküllerin x-ışını kristalografisi (MX) beamlines kullanımına yol açmıştır. Ancak, çoğu İmkanları hala deneyler gerçekleştirmek için bir bilim adamı Çekme Makinası varlığını gerektirir. Otomatik beamlines tam otomatik karakterizasyonu ve veri toplama, adanmış yeni nesil kristalleri biyolojik oluştururlar, son zamanlarda geliştirilmiştir. Bu beamlines ilk kristalizasyon denemeler ve/veya kırınım veri kümeleri, çok sayıda topluluğu sonuçlarını beamline kendilerini kontrol zorunda olmayan kullanıcılar ekran yapısal biyologlar için yeni bir araç temsil eder. Burada nasıl bir deney otomatik tarama ve veri toplama, için göstermek nasıl bir deney beamline yapılır, nasıl elde edilen veri kümesi işlenir ve nasıl, mümkün olduğunda, biyolojik makromolekül kristal yapısı çözülmüş olacak.
Spesifik proteinlerin üç boyutlu yapısını belirleme Biyolojide çok önemlidir. İşin üzerinden elde edilen bilgi çok biyolojik işlev ve şekil ve özgüllük molekül altında eğitim içerdiği etkin ve/veya bağlayıcı sitelerin bir ışık tutuyor. Çoğu durumda, bu potansiyel mekanizmaları tespit edilecek veya uygun yerde, için eylem sağlar gelişmiş olması tedavi molekülleri. MX yapısal bilgi elde etmek için en sık kullanılan teknik, ama bir performans sorunu iyi diffracting kristalleri elde etmek için en uygun koşullar belirlenmesi. Bu nedenle, kristalizasyon denemeler çok sayıda farklı koşullarda yapılır ve daha sonra kırınım veri toplamak için kullanılacak en iyi kristalleri bulmak için ekranlı. Kristalizasyon denemeler1 Kur Otomasyonu açıkça bu konuda yardımcı oldu. Ancak, sonraki adımları (yani, kristal montaj, kırınım tarama ve kırınım veri toplama) genellikle el ile bir sürü zaman, çaba ve kaynakları kadar alarak devam etmektedir. Bu nedenle, otomasyon kırınım tarama ve veri toplama zaman ve verimlilik büyük bir kazanç demektir.
MX kırınım tarama ve veri toplama en sık hangi otomasyon kolaylaştırdı büyük ölçüde bu işlem sinkrotron MX beamlines yapılır. Ancak, çoğu durumda, bu bilim adamı bir deney sırasında beamline bulunması veya uzaktan çalıştırmak için gereklidir. Son zamanlarda, tümüyle otomatik MX beamlines yeni nesil gelişmiş2oldu. Burada, kullanıcıların fiziksel olarak veya uzaktan, deneysel bir oturum sırasında bulunması gerekmez. Bu gece, tarama kristaller ve kırınım verilerin toplanması daha az rutin görevleri, harcama tüm gün yerine ve genellikle daha fazla vakit geçirmek için bilim adamları sağlar. Dünyanın ilk tam otomatik beamline ağır otomatik örnek seçimi entegre tesis (MASSIF-1, ID30A-1)2,3 Avrupa sinkrotron radyasyon tesisi (ESRF), olduğunu. Beamline’nın gonyometre4,5olarak da davranır bir robot örnek değiştirici ile tandem örnek içeren bir yüksek kapasiteli dewar çalıştığı bir benzersiz örnek ortamına sahiptir. MASSIF-1’dir sabit bir dalga boyu 0.969 çalışan bir tek foton sayma hibrid piksel dedektörü ile6, donanımlı bir undulator beamline Å (12,84 keV) yoğun bir röntgen ışını (2 x 1012 fotonlar/s) ile. Örnek konumundaki ışın boyutu en az 10 µm (yuvarlak kiriş) en fazla 100 µm x 65 µm (yatay dikey kiriş boyutuna göre) arasında ayarlanabilir. Ortalama olarak, beamline işlemek, tamamen otomatik (aşağıya bakınız), 120 kristalleri 24 h moda. Beamline operasyon iş akışları7her biri altında eğitim örnekten en iyi olası veri ölçüm sağlamak için akıllı kararlar iş akışında, önceki adımları sonucunu temel alır, bir dizi dayanmaktadır. Özellikle, tek tek bir örnek kırınım özelliklerinin değerlendirilmesi hesap kristal birim ve akı alır ve sağlar, kristal kristal yalnızca en iyi bölgesi sonraki veri için kullanılır röntgen ışını daha büyük nerede koleksiyon. Böylece, kırınım veri kümeleri için simge durumuna küçültülmüş radyasyon hasarı2,3ile maksimum çözünürlük getirilmiştir. Zorlu veri koleksiyon, her iki yerel ve tek dalga boyu anormal kırınım (SAD) veri toplama için sözde Helisel (çok pozisyonlu) veri toplama stratejileri gibi aynı zamanda kullanılabilir8iletişim kurallarıdır.
Kristallerin istenen beamline donanımları standart için uygun bir manyetik örnek mount montaj omurga9istenen deneysel parametreleri girmeden, iğne ve tamamen otomatik deneyler MASSIF-1 dahil cryocooling ‘ kırınım planı ‘ masa Protein kristalografi beamlines (ISPyB) için10, MX deneyler, bir örümcek ağı esaslı bilgi yönetim sistemi entegre sisteminde ve örnekler için beamline gönderme. ESRF tüm örnekleri / beamline dan taşıma maliyetlerinin ESRF kullanıcı Office tarafından desteklenen (Ayrıntılar için ESRF11 Web sitesine bakın). MASSIF-1, döngü boyutu üzerinde hiçbir kısıtlamalar konur veya crystal kalite. İçin verilen bir kristal kırınım planı seçerken, kullanıcı varsayılan ayarları kullanabilir veya her örnek için özelleştirilebilir belirli iş akışları arasından seçim. Birkaç önceden programlanmış iş akışları kullanılabilir. MXPressE3 iş akışında örnek içeren döngünün ilk optik merkezleme kullanarak örnek konumunu hizalanır. Sonra X-x-ray tabanlı merkezleme kristalin en iyi bölge için röntgen ışını ortalanır sağlar. Veri toplama stratejileri sonra eEDNA, özellikle hesap kristal birim ve beamline, gerçek zamanlı akışa dikkate alarak online veri analizi X-ray deneyler alanında için eklenti tabanlı uygulamalar geliştirmek için bir çerçeve kullanılarak hesaplanır. Tam kırınım veri kümesi koleksiyonu, bu daha sonra bir dizi otomatik veri işleme boru hatları12 kullanılarak işlenir ve sonuçları ISPyB içinde muayene ve indirmek için kullanılabilir yapılır. MXPressE SAD3 iş akışı hedef protein kristalleri selenomethionine içeren hedefleniyor ve Se K kenarına MASSIF-1’in işletim enerjidir aslında patlatır. Burada, MXPressE eEDNA veri toplama stratejisi üzgün veri toplama için optimize edilmiştir (yani, yüksek fazlalık ve Bijvoet çiftleri arasında Rbirleştirme % 5 altında olduğu yere ayarla çözünürlük ile). Kırınım özellikleri bir dizi kristalleri sonraki veri toplama olmadan ekran için MXScore3 iş akışı analiz kristalleri tam kalite değerlendirilmesi üretmek için kullanılabilir. MXPressI3 iş akışında 180 ° dönüş veri 0.2 ° salınımlar ve başlangıç phi açı ve bir eEDNA strateji tarafından belirlenen çözünürlük kullanarak toplanır. MXPressO 3 iş akışı içine preobserved bir çözünürlük içerir (varsayılan: ddk = 2 Å). Bir kristalizasyon deneme kaynaklanan kristalleri ilk bir değerlendirmesini yapmak, MXPressM3 iş akışı sunulmaktadır. Bu yüksek doz kafes gerçekleştirir örnek destek hiçbir veri toplama ile en geniş yönünü üzerinden tarama veya merkezleme. Son zamanlarda, iki yeni deneme iş akışları, MXPressP ve MXPressP_SAD, pseudohelical Veri toplamalarını gerçekleştiren uygulanan8olmuştur. Tüm iş akışları tüm adımlarını yürütülmesini çevrimiçi ve gerçek zamanlı olarak takip edilebilir kullanıcı, ISPyB tarafından.
İşte tam otomatik bir MX deney MASSIF-1 karşı hazırlıklı olma ve almak ve deneyden kaynaklanan verileri çözümlemek göstermektedir. Örnek olarak, biz insan mitokondriyal glisin bölünme sistem protein H (GCSH) kullanın. Bu lipoic asit içeren protein glisin bölünme sistem glisin bozulması için sorumlu bir parçasıdır. Bu sistem daha fazla P protein, piridoksal fosfat bağımlı glisin dekarboksilaz, T protein, tetrahydrofolate gerektiren bir enzim ve lipoamide dehidrogenaz L protein içerir. GCSH glisin methylamine grup T protein P protein aktarır. H protein kusurları insanlar13‘ te nonketotik hiperglisinemi (NKH) neden olur.
Tam otomatik beamlines otomatik karakterizasyonu ve veri toplama makromoleküllerin kristalleri varlığı olmadan çok sayıda gelen bir bilim adamı, beamline veya uzaktan, gerekli sağlar. Tümüyle otomatik beamlines kullanarak el ile çalışması için karşılaştırıldığında pek çok avantajı vardır. İçin örnek, merkezleme, otomatik örnek x-ışını mesh temel ve satır tarar, daha kesin insan gözü ile gerçekleştirilen daha termal veya optik etkileri tarafından etkilenmez. Nitekim, bu mesh ve satır taramalar veri toplamak için kullanılacak doğru ışın boyutu belirlemede önemli olan ek veri (yani, kristal ve kristalin bölge diffracting en iyi detaylı boyutları) sağlamak — özellikle küçük kristalleri için 18— ve genellikle elde edilen kırınım veri kalitesinin bir neden. Ayrıca, kullanıcı tanımlı parametreleri otomatik deneyler kurulumunda yararlanarak, belirli iş akışları adımda en uygun sistem altında eğitim, böylece daha fazla deney başarı oranı en iyi duruma getirme için uygun olabilir.
Birlikte, iş akışları kullanılabilir, beamline (bir takvim [yukarı bakın] kullanan kullanıcılar otomatik olarak zamanlama,) ve MASSIF-1’in tam otomatik yaklaşım kolay erişim sağlar titiz, güvenilirliği yüksek üretilen iş ve zaman kazandıran alarak Klasik uygulamalı MX deneyler ve daha gelişmiş işlemleri ve uygulamaları otomatik iş akışları içine uygulamak için potansiyel alternatif. Yakın gelecekte, kristal haritacılık 3D19 kristal dehidratasyon deneyler20gibi daha karmaşık protokoller otomatik yapılır iken X-ray, merkezleme doğruluğunu geliştirmek için uygulanacaktır. Bu tamamen özerk veri toplama kötü kristalleri diffracting ve otomatik olarak faz sağlayan çok sayıda tarama en iyi duruma getirme MX, küçük molekül parça ekranlar için yüksek kaliteli veri sağlayan standart bir yöntem olacağını ümit ediliyor Kristal yapıları de novo çözmek için bilgi. Kristalleri21otomatik hasat içinde gelişmeler ile birlikte, protein kristal yapısı çözüm imkanı otomatik bir servis olarak iyi bir gerçeklik haline gelebilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar ESRF beamtime için teşekkür ederim.
Beamline MASSIF-1 | ESRF | ||
BL21DE3 | New England Biolabs | C2527I | |
chloramphenicol | Roth | 3886.1 | |
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
Dialyzing membrane | Spectrumlabs | 132655 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Dnase | Roche | 11284932001 | |
DTT | Euromedex | EU0006-B | |
EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
IPTG | Euromedex | EU0008-B | |
LB medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
lipoic acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
loop | Hampton Research | HR8-124 | |
lysozyme | Roche | 10 837 059 001 | |
MonoQ 5/50 GL | GE healthcare | 17-5166-01 | |
NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
SPINE pucks | MiTeGen | SKU: M-CSM003-0001A | |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
Sodium Formate | Sigma-Aldrich | 1064430500 | |
GCSH purification buffer | 20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl | ||
GCSH cryo-protection buffer | 0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol | ||
Programs: | |||
MxCube | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010) | local development | |
ISPyB | ESRF | Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 | local development |
MXCube2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014). | local development |
BES workflow server | Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012). | ||
DOZOR | ESRF | Bourenkov and Popov, unpublished | local development |
BLISS beamline control | Guijarro, M. et al. BLISS – Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018). | local development | |
AUTO processing of images | Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013) | local development | |
BEST and EDNA | Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009). | local development | |
CCP4 | Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011). | ||
Phaser MR | McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007). | ||
Coot | Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004). | ||
refmac5 | Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240–255 (1997). | ||
Matthews | Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968). |