Здесь мы представляем протокол проверки в естественных условиях на основе гидрогеля клеточной терапии, иллюстрируется на примере островок пересадке. h сальниковая островок матрица наполнения (приводная) Имплантация позволяет имплантация клеток гидрогеля смесь между сальниковый слои, вблизи кровеносных сосудов, чтобы максимизировать приживления в надлежащих условиях метаболических.
Регенеративной медицины, основанной на клеточной терапии представляет новую надежду для лечения болезни. Текущие препятствия включают надлежащее в естественных условиях проверки эффективности терапии. Для передачи получателя тело клетки часто должны сочетаться с биоматериалов, особенно гидрогели. Однако проверка эффективности такого трансплантата требует право окружающей среды, право гидрогеля и сайт право получателя. Сальника может быть такой сайт. Основываясь на примере трансплантации островковых, мы разработали метод самонаведения (h сальниковая островок матрица наполнения), который состоит из инъекции трансплантата внутри ткани, между сальниковый слоями, для улучшения островок имплантации и выживания. Для достижения этой цели, островки должны быть встроены в гидрогеля с вязкость, что позволяет ее с помощью атравматической иглой инъекции. Шприцы, загружаются с сочетанием гидрогеля и островков. Несколько инъекций выполняются внутри сальниковый ткани в различных въезда, и осаждения островок/Гидрогель смеси производится вдоль линии. Мы протестировали возможности этот новаторский подход с использованием бисера декстрана. Бусины были хорошо распространилась сальниковый ткани, в непосредственной близости от кровеносных сосудов. Чтобы проверить эффективность трансплантата, мы пересаженные островки в диабетической крысы и выполнять метаболических последующих более двух месяцев. Пересаженные островки выставлены высокий уровень повторного васкуляризации вокруг и внутри островков и обратить вспять диабета. Приводная техника может применяться для других типов, гидрогеля или клетки терапии, для ячеек с высокой метаболической активностью.
Клеточная терапия является горячей темой, поскольку она направлена на лечение заболеваний на основе регенеративной медицины. Биологического материала с помощью клеточной терапии во все большей степени изучены в последние годы, особенно потому, что клетки имплантации часто требует перевозчику для передачи клетки от культуры блюдо к получателю. Биоматериал подмостей являются потенциально ценные клеток перевозчиков, которые выполняют несколько функций1. Компетентные перевозчика следует защитить клетки от механических напряжений и благоприятного роста условия, такие как основные факторы роста, метаболические отходы экскреции, обмен питательных веществ и кислорода2.
Среди различных видов биоматериалов, используемых в клеточной терапии гидрогели имеют много преимуществ. Они являются биосовместимыми, биоразлагаемые, легко справиться и облегчения диффузии кислорода3. Кроме того текущие технология позволяет использовать гидрогелей помочь выжить и привить с, например, добавок факторов роста или матрица внеклеточных белков4клетки.
Гидрогель носителей, содержащих стволовые клетки могут быть введены как лечения, например, костной регенерации нервной системы и5 болезни6. Имплантация метаболически активных клеток необходима. Хотя в пробирке проверки подход возможен, инструменты и методы для проверки в естественных условиях по-прежнему уточняться.
Трансплантации клеток и гидрогелевые может легко осуществляться подкожно при биосовместимость испытания проводятся. Однако когда привитые клетки предназначены для регулирования системных факторов их метаболических действий, этот подкожной локализация не является оптимальным, по существу с точки зрения венозный дренаж7. Таким образом не существует текущих средств быстро, безопасно и эффективно оценить благотворное влияние гидрогеля. Основываясь на примере трансплантации островковых, которая требует, что гормоны выпущен в кровоток из лоскута в ответ на уровень глюкозы в крови, мы разработали новый метод для клеток/Гидрогель имплантации в естественных условиях.
Первым шагом было определить акцептора трансплантации сайт, который может принимать гидрогеля с ячейками. Сальника предлагает большое пространство для имплантации, высоко пластиковые, и ее плотных васкуляризации, в сочетании с параметром внутрибрюшинного интересна для изучения клеток, имеющих высокой метаболической активности8. Далее нам необходимо создать хирургической техники, позволяя передачу клетки и Гидрогель в сальника. Вдохновленный липофилинг, используется в пластической хирургии9, мы разработали h сальниковая островок матрица наполнения (приводная) подход. Островки, встроенные в гидрогеля вводят внутри сальниковый ткани. Техника также направлена на оказание максимальной приживления, используя несколько осаждения в сальниковый ткани, где большое количество кровеносных сосудов и улучшает оксигенацию трансплантат клеток и гидрогелевые смеси.
В настоящем исследовании мы опишем простой и инновационный метод для имплантации островке между сальниковый листы, внутри жировой ткани, ближе всего к кровеносных сосудов. Это состоит из микро инвазивной хирургии, которая может быть завершена при лапароскопии, с впрыском островков, содержащихся в Гидрогель в жировой ткани. Этот метод легко применима ко всем гидрогеля и клеток комбинации, которые должны быть проверены в в метаболически функциональной среде.
Некоторые важнейшие шаги может быть выделен в настоящем Протоколе. Во-первых лицо выполняет операции и манипуляции ткани должны быть деликатной с жировой ткани, как это хрупкое. Дробление или повреждение сальника необходимо избегать. Сальника, как защитной ткани, обогащается в макрофагов и других лейкоцитов. Эти клетки иммунной системы может быть активировано путем чрезмерной манипуляции и может негативно сказаться на трансплантат. Во-вторых важно также трансплантата (островок гидрогеля смесь) загрузка. Лицо, выполняющее процедуру необходимо избежать мертвых томов и должен загрузить все смеси Гидрогель островок в устройство впрыска. Сразу же после этого шага другой критической точки-инъекция, сам. Инъекции должны выполняться медленно, с осторожностью и деликатно. Шприц должны быть сброшены на пустой гидрогеля, первоначально загружен для извлечения любых оставшихся островков. В-третьих ушивание должно быть сделано тщательно и в два этапа. Мускулистые план следует зашивается во-первых, стараясь не шовные сальника с мышц, и кожа должна быть отдельно зашивается. Что касается процедуры эксплантация сальниковый трансплантата особое внимание должны приниматься на данный момент, когда резаная артерии близко к желудка (gastroepiploic артерий). Важно обратить внимание на любые кровотечения, которые возникают и остановить их до сшивания животного, как любые постоянные кровотечения приводит к смерти животного в течение нескольких дней.
Устранение неполадок может потребоваться относительно среднего для переноски островки; Выбор гидрогеля зависит экспериментатора, до тех пор, как Гидрогель инъекционный. Использование различных материалов может привести к переменной графт функции (с или без добавок, например). Описанный здесь метод доказал свою эффективность для инертного материала совместно рассады с соотношением островок 7660 IEQ/кг.
Нынешний метод может быть ограничена сальниковый размер и свойства гидрогеля. Чтобы использовать модель Диабетическая грызунов, инсулиновая терапия является обязательным до имплантации островок предоставлять достаточную площадь прививочных. Диабетическая грызунов потерять много веса и жировой массы благодаря СТЗ индуцированной сахарным диабетом. Учитывая небольшой вес животных, поступил в этом исследовании прививки в еще меньшей площади не представляется возможным.
Сохранения надлежащего гликемии управления (до пересадки с помощью окатышей и впоследствии пролонгированного инсулина) является обязательным. Здесь мы решили сохранить Пелле инсулина до дня пересадки по нескольким причинам. Во-первых поддержание надлежащего гликемического контроля значительно уменьшает оксидативного стресса, вызванных диабетом в получателя органов, которая может быть пагубным для островок трансплантата11 и позволяет продолжение интенсивной инсулинотерапии и получателя подготовка в клинику12. Во-вторых мы хотели, чтобы ограничить максимальное количество процедур анестезии для крыс. Относительно осуществления инсулинотерапия при метаболических последующей деятельности в связи с использованием пролонгированного инсулина схема, используемая избегать массовых осложнений из-за glucotoxicity (которая может уничтожить графтов) и сохранить значение «реальных» гликемии.
Для контроля эффективности трансплантата, гликемии является не соответствующим параметром в первые несколько дней если крысы получают инсулин терапии с использованием окатышей. Именно поэтому проверка что уровень С-пептида несколько раз до трансплантации является обязательным. Эти времена включают в начале исследования, чтобы выбрать животных после инъекции СТЗ и затем просто предыдущих трансплантации, чтобы обеспечить сохранение диабетической крысы и что регенерации является минимальным.
Гидрогель свойства также являются важными. Жидкий гидрогеля будет вытекать из сальниковый ткани и высоковязких гидрогеля не будет инъекционный. Гидрогель вязкости и injectability испытание должно проводиться перед использованием, однако представляется необходимым также проверить материал непосредственно путем оценки островок или другой выживание клетки в пробирке. Здесь как островки очень чувствительны к гипоксии и использование вязких перевозчик может повлиять на диффузии кислорода.
С точки зрения значение метода, описанного здесь относительно существующих методов этот метод трансплантации интра ткани имеет преимущества в срок воспроизводимости. Это также атравматической для ткани и, благодаря расположению экстра сосудов, избегает риски кровотечение и тромбоз. Кроме того при рассмотрении трансплантации островковых, мгновенное крови опосредованной воспалительной реакции-избегать14. Кроме того головка самонаведения позволяет пересадка островков в не-жизненно важный орган, в отличие от трансплантации в печень, которая создает риски с точки зрения функции печени15.
Для получения оптимальной производительности, гидрогеля должен быть адаптированы к клеткам, которые он будет выполнять. Использование факторов роста или специфических белков может иметь положительное влияние на пересаженные клетки16,17.
Заключить, этот метод может использоваться для проверки в естественных условиях гидрогеля на различных типов клеток, особенно когда необходимо метаболических активной среды, как островки. Кроме того Эта хирургическая техника применяется к нескольким приложениям и может быть, в будущем, быстро передаваться людям, как она может быть легко выполнена с помощью лапароскопии.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась округов Эльзас, Biovalley BioArtMAtrix-Pôle Эльзас-CQDM; 53/14/C1. Авторы благодарны команде Pr. Брюан-Rodier от больничный как де Страсбург за помощь в разработке этой инновационной техники.
Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
Ethilon 4/0isoflo | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
Needle 26G | TERUMO | 050101B | |
Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
Pentobarbital sodique | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |