Transplante de ilhotas intra-Omental usando h-Omental enchimento Matrix ilhéu (hOMING)

Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health, com o número de autorização: AL/60/67/02/13. 1. preparação destinatário Quimicamente, induzi diabetes em ratos do destinatários. Injete 75 mg/kg de estreptozotocina (STZ, em tampão de citrato estéril 0,1 M, pH 4) intraperitonealmente para ratos10.Nota: Para os estudos de transplante, foram utilizados 6 semanas Lewis estirpe ratos, pesando 150-190 g. Verificar o status de diabetes por medições diárias de glicose de sangue durante os primeiros quatro dias. Injetar insulina de ação prolongada 6 U/dia por via subcutânea, quando ratos apresentam glicemia ao longo de 2 g/L, para prevenir complicações do diabetes e perda de peso, até a implantação da pelota de insulina. Incluem ratos na coorte, quando são duas medidas de glicose no sangue veia cauda > 4-5 g/L por 2 dias consecutivos e o nível de peptídeo-C é < 200 pM. Medir a glicemia usando um glicosímetro e C-peptidemia por um ensaio imunoenzimático (ELISA). Implante de pelotas de insulina sob a pele (ver 1.2).Nota: Terapia de insulina crônica permite melhor regulação da glicemia e evita complicações do diabético (que exacerbam o stress oxidativo no local do transplante)11. Além disso, a terapia conserva o estado diabético juntamente com uma curva de crescimento normal (sem perda de peso habitual, observada em um animal diabético). Isso pode resultar em uma almofada de gordura omental maior, que é ideal para a realização de transplante. Implantação de insulina pelotas Anestesiar o rato usando anestesia de gás (3% de isoflurano em 500 mL/min O2) e coloque o rato em posição de bruços. Verificar o status de anestesia, verificando a ausência de reflexo (pata beliscar). Limpe o pescoço usando iodopovidona e raspar a região usando uma lâmina de barbear. Aplicar iodopovidona novamente e deixe por 3 min. Pelotas de insulina lugar 1.5 (3 unidades (U) / rato 200g) em uma solução de iodo povidona diluído 1:5 para esterilizar as pelotas. Perfurar a pele do pescoço usando um trocarte de 16 G e inserir a pelota usando o guia de decoração e estilete. Recuperar o guia e o estilete e costurar um único ponto. Use iodopovidona para limpar o ponto.Nota: Nenhuma dor pós-cirúrgica foi necessário à medida que a intervenção era comparável a uma única subcutânea (SC). Deixe o rato recuperar da anestesia e certifique-se de que ratos têm acesso aos alimentos para evitar a hipoglicemia. Medir a eficiência da pelota medindo-se diminuição da glicémia após a implantação. Verificar a eficiência da pelota, monitorando o nível de glicemia toda semana por 1 mês. Incluem ratos na coorte, quando uma medida de cauda veia C peptídeo no sangue é mantida abaixo dos 200 pM 1 mês após a implantação da pelota de insulina.Nota: Verificar os níveis de peptídeo-C é obrigatório para avaliar os animais na linha de base antes do transplante e confirmar seu estado diabético. Regeneração de peptídeo-C baixa sempre ocorre durante o seguimento. O C-peptidemia mais baixo é indicativo da regeneração mais baixa. 2. orientação: Matrix Intra-omental ilhéu de enchimento Preparação de mistura do Ilhéu-matriz. Prepare a transportadora ilhéu viscoso numa vizinhança de fluxo laminar. Dissolva o pó de alginato em PBS estéril na concentração de 1,5%. Esterilize a preparação por passagem através de um filtro de 0,22 µm. Prepare 400 µ l por beneficiário.Nota: Pode ser usado qualquer tipo de hidrogel com uma viscosidade adequada para a injeção com uma agulha 21G. Isole o ilhéu de saudáveis ratos Lewis (200-250 g) como descrito anteriormente,12. Contar número de Ilhéu em equivalentes de ilhéu (IEQ) (uma IEQ é considerado equivalente a uma ilhota pancreática com um diâmetro de 150 µm)13. Em uma capa de fluxo laminar, prepare alíquotas de 7660-ilhéu equivalente (IEQ) em um tubo de 1,5 mL. Lave alíquotas de ilhotas com 500 µ l de meio CMRL (Connaught Medical Research Laboratories) livre de soro fetal bovino. Ilhotas de pelotas por centrifugação (min 2 500 x g e 4 ° C). Desprezar o sobrenadante. Adicionar 150 µ l de transportadora de hidrogel de alginato sobre os ilhéus, misturar cuidadosamente pipetando para cima e para baixo e coloque a mistura sobre o gelo. Prepare uma agulha 21G de atraumática e uma seringa de 1 mL sem volume morto carregando 150 µ l de alginato vazio para a seringa. Encha a seringa com a mistura de Ilhéus e alginato (150 µ l, o volume total 300 µ l). Manter a seringa no gelo. Procedimento cirúrgico Esterilizar instrumentos cirúrgicos usando esterilização a frio (2% Steranios por 20 min). Anestesiar o rato usando anestesia isoflurano e coloque o rato em posição de bruços. Raspar a região do pescoço usando uma lâmina de barbear e esterilizar a área com iodopovidona. Deixe o iodo descansar por 3 min. Fazer uma incisão com um bisturi e remover as pelotas de 1,5 insulina usando fórceps. Feche a pele usando um ou dois pontos de ponto único. Não remova o rato da anestesia.Nota: Depois de 1 mês, o sedimento pode ser friável como algum tecido fibrótico pode embrulhar como pelotas; Use uma tesoura para dissecá-lo corretamente. Coloque o rato em posição supina. Fazer a barba e esterilizar (com iodopovidona) área peritoneal. Deixe o iodo descansar por 3 min. Crie uma laparotomia de 1,5 cm logo abaixo do esterno, usando um bisturi. Coloque gaze estéril molhado ao redor da área de incisão. Identifica o omento é a almofada de gordura localizada ao lado do estômago. Use pinças para pegar o omento com cuidado, retire-a delicadamente a cavidade peritoneal e espalhá-lo sobre a gaze.Nota: O tecido omental estende-se do baço duodeno e anexa no seu ponto médio para o estômago. O omento normal de ratos diabéticos recebendo terapia de insulina é de aproximadamente 2 cm ² quando se espalharam sobre a gaze. Hidrate o tecido omental bem usando 2 mL de solução salina estéril previamente aquecido a 37 ° C. Use pequenas pinças curvas para manipular o tecido e penetrar a borda omental com a agulha entre as camadas omental. Insira a agulha inteiramente. Iniciar a injeção da preparação Ilhéu lentamente e com cuidado de mover a agulha para trás para injetar as ilhotas em vários lugares (como linhas). Antes de retirar a agulha, certifique-se de que o hidrogel parou de sair com a agulha para evitar a perda de ilhotas dispersas. Repita esta manipulação, conforme necessário para injetar todo o conteúdo da seringa usando pontos de entrada diferentes para distribuir as ilhotas em todo o tecido omental.Nota: Em ratos, quatro ou cinco injeções são geralmente necessários. Verifique ilhotas não estão em cluster na seringa na extremidade das injeções.Nota: Se algumas ilhotas são ainda visíveis, é possível retirar a agulha da seringa, encha a seringa diretamente com 100 µ l de hidrogel vazio e reconectar a agulha. Uma segunda rodada de injeção pode ser feita para expulsar os ilhéus restantes. Use soro fisiológico esterilizado novamente para hidratar o tecido omental e a parede da laparotomia. Use fórceps para substituir cuidadosamente omento na cavidade abdominal. Injete 2 mL de solução salina estéril pré-aquecido na cavidade abdominal para Re-hidratar o rato. Feche a parede muscular usando uma sutura contínua do segmento. Em seguida, costure a camada cutânea com ponto único ponto (ponto-a-ponto). Injete meloxicam (1,5 mg/kg) por via subcutânea como um analgésico por 5 dias uma vez por dia. Coloque o rato em uma gaiola em uma almofada de aquecimento até à recuperação da anestesia. Repita o procedimento para todos os ratos do destinatários. Medir a glicose no sangue após transplante todos os dias. Se glicemia for > 2 g/L, injetar 6 U de insulina de ação prolongada por via subcutânea uma vez ao dia. Avalie a função do enxerto por glicemia e c-peptidemia de monitoramento mais 1 ou 2 meses.Nota: Em casos de transplante bem sucedido, glicemia deve estabilizar dentro de 2-5 dias após o transplante, e ratos podem ser retirados de insulina. 3. omental enxerto explantação Nota: Este procedimento permitirá a confirmação da função do enxerto boa. Após a recuperação de um enxerto funcional, ratos devem retornar a um estado diabético. Esta etapa é executada após 1 ou 2 meses de follow-up metabólica. Anestesiar o rato com anestesia de gás e colocá-lo na posição supina. Raspar a região peritoneal e esterilizar com iodopovidona por 3 min. Crie uma laparotomia de 1,5 cm logo abaixo do esterno, usando um bisturi. Coloque gaze estéril molhado ao redor da área de incisão. Identifica o omento, que fica ao lado do estômago. Use fórceps para espalhá-lo cuidadosamente sobre a gaze. Use uma tesoura para excisar o omento. Começar a partir da parte que adere sobre a cauda do pâncreas (ao lado do baço). Se o sangramento ocorre, use gaze estéril seca para detê-lo. Continuar a excisão ao longo da parte anexada ao estômago e recuperar o omento.Nota: Neste local, artérias gastroepiploica (Figura 1) podem causar uma grande quantidade de sangramento se acidentalmente são cortadas. Artéria incisões são inevitáveis para recuperar o enxerto, mas o sangramento pode ser gerenciado usando a pinça e gaze. Se acontecer um corte acidental, comprimir firmemente com uma gaze seca e manter a compressão pelo menos 1 min. O sangramento deve parar. Se não, use grampos ou usar um bisturi elétrico para cauterizar os vasos. Figura 1: distribuição da artéria Omental. Para explantação de enxerto do omento, a área crítica, composta por artérias gastroepiploica é representada em azul. Durante a ressecção desta parte do tecido omental, atenção deve estar a ser pago para a seção de artéria gastroepiploica direita. Compressão, ligadura ou cauterização pode ser usada para limitar a sangrar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Verifica se algum sangramento persiste. Se não, Injete 2 mL de soro pré-aquecido, fechar o rato e processar como descrito anteriormente. Animais explantados retornam a um estado diabético. Injeção de insulina (6 U/SC/dia) Então é obrigatória para garantir o bem-estar dos animais. Eutanásia o rato em 10 a 12 dias após explantação usando uma overdose de pentobarbital (182,2 mg/kg). 4. histológica análise: Hematoxilina e eosina coloração Corrigir o omenta obtida usando paraformaldeído 4% (PFA) e incorporar em parafina. Cortar seções 4 µm de espessura e aplique a mancha de hematoxilina e eosina para avaliação morfológica do transplante. 5. análise estatística Determine a significância estatística usando software de análise estatística e análise de medidas repetidas de variância (ANOVA) com teste de diferença de Tukey significado honesto como um teste post hoc. Representam valores de p como: *p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001.