Hier presenteren we een protocol voor in vivo validatie van hydrogel gebaseerde celtherapie, geïllustreerd door het voorbeeld van islet transplantatie. h-Omental Matrix Islet vullen (hOMING) implantatie kunt implantatie van een cel-hydrogel mengsel tussen de omental lagen, in de buurt van bloedvaten, engraftment in een juiste metabole omgeving te maximaliseren.
Regeneratieve geneeskunde op basis van celtherapie vertegenwoordigt een nieuwe hoop voor het genezen van de ziekte. Huidige hinderpalen betrekking hebben op juiste in vivo validatie van de efficiëntie van de therapie. Voor overdracht aan de ontvangende instantie moeten cellen vaak worden gecombineerd met biomaterialen, vooral hydrogels. Validatie van de werkzaamheid van een dergelijke prothese vereist echter de juiste omgeving, de juiste hydrogel, en de juiste geadresseerde website. De majus misschien wel zo’n site. Op basis van het voorbeeld van islet transplantatie, ontwikkeld we de hOMING (h-Omental Matrix Islet vulling)-techniek, die uit de injectie van de prothese binnen het weefsel, tussen de omental lagen bestaat, islet implantatie en overleving te verbeteren. Om dit te bereiken, moeten de eilandjes worden ingebed in een hydrogel met een viscositeit waarmee de injectie met behulp van een atraumatische naald. Spuiten worden geladen met een combinatie van hydrogel en eilandjes. Meerdere injecties worden uitgevoerd binnen het omental weefsel op verschillende toegangspunten, en de afzetting van het eilandje/hydrogel mengsel gebeurt langs een lijn. We testten de haalbaarheid van deze innovatieve aanpak met dextran kralen. De kralen zijn goed verspreid over de omental weefsel, in nabijheid van bloedvaten. Om te testen van de werkzaamheid van de prothese, wij getransplanteerde eilandjes in diabetische ratten en het uitvoeren van een metabole follow-up meer dan twee maanden. De getransplanteerde eilandjes tentoongesteld van een hoge mate van re vascularisatie rond en binnen de eilandjes en omgekeerd diabetes. De hOMING techniek kan worden toegepast voor andere soorten hydrogel of cel therapie, voor cellen met hoge metabole activiteit.
Celtherapie is een hot topic, aangezien het is gericht op het genezen van ziekten op basis van de regeneratieve geneeskunde. Biologische materiaal-bijgewoonde celtherapieën zijn steeds bestudeerd in de afgelopen jaren, vooral omdat cel implantatie vaak een drager voor de overdracht van de cellen van de cultuur-schotel naar de ontvanger vereist. Biomaterial steigers zijn potentieel waardevolle cel dragers die voldoen aan meerdere rollen1. Een bevoegde drager moet beschermen cellen tegen mechanische belasting en bieden gunstige groei-omstandigheden, zoals essentiële groeifactoren, metabolische afvalstoffen uitscheiding, uitwisseling van voedende stoffen en zuurstof2.
Onder de verschillende soorten biomaterialen gebruikt in celtherapie, hebben hydrogels veel voordelen. Ze zijn gemakkelijk te hanteren, en vergemakkelijken van de diffusie zuurstof3, biocompatibel, biologisch afbreekbaar. Huidige technologie kunnen bovendien het gebruik van hydrogels te helpen cellen overleven en engraft met, bijvoorbeeld, suppletie met groeifactoren of de extra-cellulaire matrix eiwitten4.
Hydrogel vervoerders met stamcellen kunnen worden geïnjecteerd als behandelingen, bijvoorbeeld bot regeneratie5 en zenuwstelsel ziekte6. De inplanting van metabolisch actieve cellen nodig is. Terwijl in vitro validatie van de aanpak mogelijk is, instrumenten en technieken voor in vivo validatie moeten nog worden verfijnd.
Cel en hydrogel transplantatie kan gemakkelijk worden uitgevoerd door subcutane injectie wanneer biocompatibiliteit testen worden uitgevoerd. Dit subcutane lokalisatie is echter niet optimaal, hoofdzakelijk op het gebied van de veneuze drainage7als geënte cellen zijn bedoeld voor het regelen van systemische factoren door hun metabole actie. Daarom zijn er geen huidige tools om snel, veilig en efficiënt de gunstige effecten van een hydrogel. Op basis van het voorbeeld van islet transplantatie, die vereist dat hormonen worden vrijgelaten in de bloedbaan van de prothese in reactie op de niveaus van de glucose van het bloed, ontwikkeld wij een nieuwe methode voor cel/hydrogel implantatie in vivo.
De eerste stap was om te identificeren een acceptor transplantatie site, die een hydrogel met cellen kan aanvaarden. De majus biedt een grote ruimte voor implantatie, is zeer plastic en zijn dichte vascularisatie in combinatie met het intraperitoneaal instelling is interessant voor de studie van cellen met hoge metabole activiteit8. Vervolgens moesten we stellen een chirurgische techniek waardoor de overdracht van de cellen en de hydrogel in de majus. Geïnspireerd door de lipofilling gebruikt in plastische chirurgie9, ontwikkelden we de h-Omental Matrix Islet vullen (hOMING) aanpak. Eilandjes ingebed in hydrogel worden geïnjecteerd in de omental weefsel. De techniek ook gericht op het bieden van maximale engraftment door gebruik te maken van meerdere afzettingen van de cel en hydrogel mengsel in de omental weefsel, waar het grote aantal bloedvaten ook graft oxygenatie verbetert.
In de huidige studie beschrijven we een eenvoudige en innovatieve techniek voor islet implantatie tussen omental bladen, binnen het dichtst bij de bloedvaten vetweefsel. Dit bestaat uit micro-invasieve ingreep, die kan worden voltooid onder laparoscopie, met de injectie van eilandjes die zijn vervat in een hydrogel naar het vetweefsel. Deze techniek is gemakkelijk van toepassing op alle hydrogel en cel combinaties die worden getest moeten een in een metabolisch functionele omgeving.
Sommige kritische stappen kunnen worden benadrukt in dit protocol. Eerst moeten de persoon uitvoeren de chirurgie en manipuleren van de weefsels de delicate met het vetweefsel, want het is kwetsbaar. Breken of beschadigen van de majus moet worden vermeden. Majus, is als een defensieve weefsel, verrijkt met macrofagen en andere leukocyten. Deze immuuncellen kunnen worden geactiveerd door buitensporige manipulatie en negatief van invloed kunnen zijn op de prothese. Ten tweede, graft (islet-hydrogel mengsel) laden is ook cruciaal. De persoon die u de procedure uitvoert dode volumes moet voorkomen en alles wat van het mengsel hydrogel-eilandje in de injectie-apparaat moet laden. Onmiddellijk na deze stap is een ander kritisch punt de injectie zelf. Injectie moet langzaam, voorzichtig en tactvol worden uitgevoerd. De spuit moet worden gespoeld door de lege hydrogel geladen in eerste instantie om op te halen van eventuele resterende eilandjes. Ten derde moet wordt dit zorgvuldig en in twee stappen. De gespierde plan eerst moet worden ingehecht verzorgen niet te suture de majus met de spier, en de huid moet afzonderlijk worden ingehecht. Met betrekking tot de explantatie procedure voor de omental prothese, moet bijzondere aandacht worden gehouden op het moment wanneer de slagaders vlakbij de maag (gastroepiploic slagaders) worden ingesneden. Het is belangrijk aandacht te besteden aan elke bloeduitstortingen die optreden en stoppen hen voordat het dier wordt als een hardnekkige bloedende leidt tot dier dood binnen enkele dagen.
Probleemoplossing kan het nodig zijn met betrekking tot het medium voor de uitvoering van de eilandjes; de keuze van hydrogel is aan de experimentator, zolang de hydrogel injecteerbare. Het gebruik van verschillende materialen kan resulteren in variabele graft functie (met of zonder suppletie, bijvoorbeeld). De hier beschreven methode is gebleken de efficiency voor inert mede transplanteren materiaal met een eilandje ratio van 7660 IEQ/kg.
De huidige methode kan worden beperkt door de grootte van de omental en de hydrogel eigenschappen. Als u wilt gebruiken een diabetische knaagdier model, is insuline therapie verplicht om voldoende praktijk gebied vóór eilandje. Diabetische knaagdieren verliezen veel gewicht en vet massa als gevolg van STZ veroorzaakte diabetes. Gezien het geringe gewicht van de dieren ingeschreven in deze studie, is enten in een nog kleinere ruimte niet mogelijk.
Behoud van de juiste glycemia beheer (voor transplantatie pellets en daarna gebruik van langwerkende insuline) is verplicht. Hier, wij hebben gekozen voor de instandhouding van de insuline-pellet tot de dag van transplantatie voor verschillende redenen. Ten eerste vermindert het behoud van een goede glycemische controle aanzienlijk oxidatieve stress veroorzaakt door diabetes in de ontvangende organen, die kunnen schadelijke voor islet graft11 en maakt voortzetting van intensieve behandeling met insuline en ontvanger voorbereiding waargenomen in de kliniek12. Ten tweede, we wilden beperken van het maximale aantal verdoving procedures voor de ratten. Met betrekking tot de uitvoering van de behandeling met insuline tijdens de metabole follow-up gebruik van langwerkende insuline, vermeden de regeling gebruikt massale complicaties als gevolg van glucotoxicity (die kan vernietigen enten) en voor de instandhouding van een “echte” glycemia waarde.
Als u wilt controleren graft-efficiëntie, is glycemia niet een relevante parameter in de eerste paar dagen als ratten ontvangt insuline therapie met behulp van pellets. Dit is de reden waarom de controle op het C-peptide niveau meerdere malen voorafgaande transplantatie is verplicht. Deze tijden opnemen aan het begin van de studie, dieren na STZ injectie, selecteren en vervolgens gewoon voorafgaand aan transplantatie, om ervoor te zorgen dat ratten diabetische blijven en dat regeneratie minimaal is.
Hydrogel eigenschappen zijn ook belangrijk. Vloeibare hydrogel zal lekken uit omental weefsel en niet zal zeer viskeuze hydrogel injecteerbare. Hydrogel viscositeit en injectiecapaciteit moet worden getest voordat u gebruikt, maar het lijkt essentieel om ook het materiaal rechtstreeks door evaluatie van eilandje of een andere cellen voortbestaan in vitro testen. Hier als eilandjes zeer gevoelig aan hypoxie en het gebruik van een zeer viskeuze vervoerder zijn kunnen invloed hebben op diffusie van zuurstof.
In termen van het belang van de hier beschreven met betrekking tot bestaande methoden methode, heeft deze intra-weefsel transplantatie-techniek voordelen in termen van reproduceerbaarheid. Het is ook atraumatische voor het weefsel en, vanwege de extra vasculaire ligging, vermijdt bloedingen en trombose risico’s. Ook bij het overwegen van islet transplantatie, is onmiddellijke bloed-gemedieerde inflammatoire reactie vermeden14. Voorts staat hOMING transplanteren eilandjes in een niet-vitale orgaan, in tegenstelling tot transplantatie in de lever, die risico’s op het gebied van hepatische functie15 levert.
Voor de productie van optimale prestaties, moet een hydrogel worden aangepast aan de cellen die zal dragen. Gebruik van groeifactoren of specifieke proteïnen kan hebben een positief effect op de getransplanteerde cellen16,17.
Tot slot kan deze techniek worden gebruikt voor in vivo validatie van een hydrogel op verschillende soorten cellen, met name wanneer een actieve metabole omgeving nodig is, wat eilandjes. Bovendien, kan deze chirurgische techniek geldt voor meerdere toepassingen en, in de toekomst snel overdraagbaar op de mens, zoals eenvoudig kan worden uitgevoerd met behulp van laparoscopie.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de regio Elzas, CQDM-BioArtMAtrix-Pôle Elzas Biovalley; 53/14/C1. De auteurs zijn dankbaar aan het team van Pr. Bruant-Rodier van de Hôpitaux Universitaires de Strasbourg voor het helpen ontwikkelen van dit innovatieve techniek.
Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
Ethilon 4/0isoflo | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
Needle 26G | TERUMO | 050101B | |
Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
Pentobarbital sodique | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |