Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток

Активация и пролиферацию клеток T являются важнейшие шаги для монтажа успешных иммунных реакций. Последние достижения показывают, что тесно связано с развитием и функции клеток T клеточный метаболизм. К примеру наивно T клетки полагаются в основном на окислительное фосфорилирование (OXPHOS) для удовлетворения спроса на энергию во время рециркуляции среди средних лимфоидных органов. После активации наивно T клетки претерпевают радикальные метаболических перепрограммирования, включая индукцию аэробного гликолиза для увеличения производства АТФ и выполнить огромную метаболические требования во время дифференцировки клеток и распространения. Клетки, которые не в состоянии следовать через метаболические потребности умирают апоптоза на^1,2. В ходе метаболических перепрограммирование, митохондрии играют важную роль, поскольку они являются органеллы, значительной степени ответственность за производство АТФ для поставлять энергию для ячейки, и содержание сотовой митохондрий колеблется в ходе метаболических переключатели на протяжении Т-клеток развития и активации³. Однако накоплением лишних или повреждения митохондрий могут производить избыток рос, что повреждения липидов, белков и ДНК и в конечном итоге может привести к смерти⁴ ячейки

Чрезмерное или повреждения митохондрий, результатом метаболические изменения удаляются специализированной формой autophagy⁵, известный как mitophagy. Митохондрии окружены autophagosomes и затем сливается с лизосомы для деградации. Закрыть эти связи между митохондрии и лизосом вызвали большой интерес в^6,7. К примеру, оксидативный стресс стимулирует митохондрии составить производными митохондрий везикулы (MDVs), которые предназначены для лизосомы деградации в фосфатазы и натяжение гомолога (PTEN)-индуцированной предполагаемого киназы 1 (PINK1) и Паркин (E3 убиквитин лигаза) ⁸зависимым образом. Было также установлено, что mitophagy имеет важное значение для перехода бежево белый Адипоцит^9,10. Что еще более важно лизосомы являются не просто деградации отсек, но и регулятор клеточных сигналов. Накопление чрезмерного субстрат из-за недостатков фермента приводит к лизосомальных дисфункции, нарушая лизосомальных мембран проницаемости и влияет на Ca^{2 +} гомеостаза¹¹. Т-клеток функциональных дефектов в лизосомальных кислоты липаза (Лал)¹² или лизосомальных метаболит транспортер нокаут мыши модель¹³ далее показали важность лизосом в поддержании гомеостаза Т-клеток. Митохондрии и лизосом являются неотъемлемой частью клеточной регуляции метаболизма. Таким образом измерение содержания клеточных митохондриальной был решающую показателем для оценки состояния обмена веществ и функциональных Т-клеток.

Анализы, обычно используется для количественного определения сотовой митохондриальной или лизосомальных содержимое включают immunoblot, электронная микроскопия, immunofluorescent окрашивание (КРП) и ПЦР-анализа митохондриальной ДНК копировать номера^{14,15, 16}. Эти анализы, хотя immunoblot можно количественно сравнить уровни белка через различных образцов и электрон или если микроскопии можно визуализировать морфологические признаки эти органеллы¹⁷, несут определенные технические недостатки. Например это много времени приобрести достаточное количество клеток изображений с высоким увеличением и резолюции или сравнить уровни выражения протеина через десятки образцов, что делает эти анализы, считается низкой пропускной способности методы. Кроме того эти анализы может применяться только населению однородных клеток, таких как клеточных линий, но не для образцов тканей, которые состоят из смешанного населения.

Это также трудно применять эти анализы редких населения, для которых требование о минимальной ячейки чисел от 10⁶ -10⁸ невозможно соблюсти. Наконец клетки обычно лизированы или фиксированной во время процесса, что делает их несовместимыми с другими методами для получения дальнейшей информации. По сравнению с традиционными методами, на основе люминесцентных проточной цитометрии имеет относительно высокую пропускную способность – информация из всех клеток в образце состоит из смешанных клеточных популяций могут быть проанализированы и собранные одновременно. Кроме того можно обнаружить более 10 параметров на той же клетке и Сортировка ячеек, основанных на желаемый фенотипы для дальнейших анализов. Реактивная флуоресцентных зондов были использованы для обозначения лизосом и митохондрий в живых клеток и может быть обнаружен поток цитометрии^18,19. Эти зонды органеллы конкретных клеток проницаемых и физико химические характеристики, которые позволяют им быть сосредоточены в определенных местах субцеллюлярные или органеллы. Удобно эти датчики доступны в различных форматах флуоресцентные, таким образом позволяя их применение для многоцветного анализа.

Этот протокол описывает подробно как совместить поверхности маркер, окрашивание красками Лизосома или митохондрии специфичные для метки лизосомы или митохондрий в живой клетки. Это особенно полезно для образцов, созданных из основной ткани и органы, которые часто состоят из гетерогенных клеточных популяций. Исследователи могут определить клеточных популяций интерес выражением их поверхности маркер и конкретно измерить лизосомальных или митохондриальной содержимое через органеллы конкретных красителей в этих клетках. Здесь мы демонстрируем подробную процедуру анализа гранулярных потока, который оценивает лизосомальных или митохондриальной массы в основных селезеночной Т-клеточной субпопуляций.