Hier präsentieren wir Ihnen die Einzelheiten des Verfahrens einer neu entwickelten Protease Assays Plattform nutzen N-terminalen Hexahistidine/Maltose-bindendes Protein und fluoreszierende Protein fusioniert rekombinante Substrate an der Oberfläche der Nickel-Nitrilotriacetic befestigt saure magnetische Agarose Korne. Eine anschließende Gelanalyse der Assay-Proben durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt wird ebenfalls dargestellt.
Proteasen sind intensiv untersuchten Enzyme aufgrund ihrer wesentlichen Aufgaben in mehreren biologischer Signalwege von lebenden Organismen und Pathogenese; Sie sind daher wichtige Drogeziele. Wir haben eine magnetische-Agarose Bead-basierte Test-Plattform für die Untersuchung der proteolytischen Aktivität entwickelt, auf den Einsatz von rekombinanten Fusion Protein Substrate basiert. Um die Verwendung von diesem Testsystem zu zeigen, wird ein Protokoll am Beispiel des humanen Immundefizienz-Virustyp 1 (HIV-1) Protease vorgestellt. Die eingeführten Assay-Plattform genutzt werden effizient in die biochemische Charakterisierung der Proteasen, einschließlich der Enzym-Aktivität-Messungen in Mutagenese, kinetische, Hemmung oder Spezifität Studien, und es möglicherweise für Hochdurchsatz-geeignet Substrat-Screening oder anderen proteolytischen Enzymen angepasst werden kann.
In diesem Testsystem Spaltstellen für Tabak Ätzen Virus (TEV) und HIV-1-Proteasen und eine C-terminale fluoreszierenden Proteins, der eingesetzten Substrate enthalten N-terminalen Hexahistidine (seine6) und Maltose-bindende Protein (MBP) Tags. Die Substrate in Escherichia coli Zellen effizient herstellbar und leicht gereinigt mit Nickel (Ni) – Chelat – beschichtete Perlen. Während der Test führt der proteolytische Spaltung von Perle befestigt Substraten zur Freisetzung fluoreszierende Spaltung Fragmente, die durch Fluorimetry gemessen werden kann. Darüber hinaus können die Spaltung Reaktionen von Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert werden. Ein Protokoll für die in-Gel-Renaturierung von Assay Komponenten ist auch beschrieben, wie teilweise Renaturierung von fluoreszierenden Proteinen ihre Erkennung anhand Molekulargewicht und Fluoreszenz ermöglicht.
Proteolytische Enzyme gehören zu den am intensivsten untersuchten Enzym Gruppen aufgrund ihrer Bedeutung in Stoffwechselwege und in industriellen Anwendungen sowie. Ihre Schlüsselrolle bei Viruserkrankungen, die Regulierung der Blutgerinnung, Krebs und Herz-Kreislauf- und neurodegenerativen Erkrankungen macht Proteasen wichtige Ziele auf dem Gebiet der Wirkstoffforschung. Daher die detaillierte Charakterisierung der Substratspezifität und Inhibitor Profilierung der Protease (PR) von Interesse ist von zentraler Bedeutung und erfolgt vorzugsweise durch schnelle, kostengünstige und robuste biochemischen Assays1,2, 3.
Heutzutage sind die überwiegende Mehrheit der in-vitro-Protease Assays angewendet im Bereich der Arzneimittelforschung für zusammengesetzte Profilerstellung homogene, fluoreszierende Peptid-basierte und Hochdurchsatz-Screening (HTS)-kompatiblen Plattformen4. Darüber hinaus beschriftete Peptide sind nicht nur für Bibliothek Screening geeignet, aber sie bieten auch große Werkzeuge für die Bestimmung des Enzyms kinetische Parameter der ausgewählten Substrate. In anderen Fällen, wo Kennzeichnung des Substrates nicht möglich ist, können die Trennung basierende Assays eine mögliche Lösung für die kinetischen Eigenschaften der proteolytischen Reaktionen3bewerten.
In der Regel in-vitro-Protease Assays basieren auf der Verwendung von zwei Arten von Substrat: kurze Peptide oder ganze Proteine. In den Fällen, wo die Spaltung von kurzen Peptid-Sequenzen entsprechen die Spaltung Eigenschaften ausreichend, gelten die folgenden Standardansätze: (i) standard Protein Substrate wie oxidierte Insulin B-Kette, (Ii) Prüfung Prüfung im Handel erhältlichen Substrate von anderen Proteasen, (Iii) screening synthetischer und Gewebekulturen beschriftet Peptid Bibliotheken erstellt von kombinatorischen Chemie oder (iv) mit genetischen Methoden, zum Beispiel biologische anzeigen Technologien5, 6. Neben der konventionellen Klassifikation, andere neuartigen Plattformen sind erhältlich für Substrat Generation (z. B. die Bildung von Proteom-abgeleitete Peptid Bibliotheken7 oder spezielle Subtypen von genetischen Methoden, wie die rekombinante Fusion Protein-basierten Substrate8,9,10,11,12).
Alle der oben genannten Substrat Typen und Tests haben ihre eigenen Vorzüge und Grenzen, und die Entwicklung von Assays Formaten kombiniert und/oder die Vorteile der bekannten Plattformen zu verbessern ist nach wie vor gefragt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine Trennung-basierte fluoreszierende Protease-Assay, der rekombinante Substrate verwendet. Diese Schmelzverfahren Proteine bestehen aus seinen6 und MBP Tags verschmolzen zu einem Steuerelement Spaltstelle von TEV PR, gefolgt von der Substrat-Reihenfolge des Interesses, die direkt mit einer C-terminalen fluoreszierenden Proteins (FP) (Abbildung 1A) verbunden ist. Das Klonen einer DNA-Sequenz, die Codierung für eine Spaltstelle von Interesse in der “Klonen Kassette” kann durch einen einzigen Ligatur Reaktion in das Expressionsplasmid durchgeführt werden, die zuvor durch Beschränkung Endonucleases linearisiert worden.
Abbildung 1: Prinzip des fluoreszierenden Protease Assays. (A) die schematische Darstellung von einem fluoreszierenden Substrat und seiner Spaltung durch humane Immundefizienz-Virustyp 1 (HIV-1) Protease wird angezeigt. Der Pfeil zeigt die Position der Spaltung innerhalb der Matrix/Kapsid Spaltung Website Sequenz von HIV-1 Protease (VSQNY * PIVQ). (B) die fluoreszierenden Substrate können verwendet werden, Enzymreaktionen analysieren durch Ni-NTA magnetischer Wulst-basierende Assays und Polyacrylamid Gelelektrophorese, ebenso, wie in der Workflow-Abbildung dargestellt ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Obwohl proteolytischen Assays mit ähnlichen rekombinanten Proteins Substrate-mit einer Affinität-Tags, eine proteolytische Spaltung-Website und ein fluoreszierendes Protein-Have bereits beschrieben wurden8,9,10, das System präsentiert hier beabsichtigt, zu integrieren und auf die Vorteile dieser Methoden zu verbessern. Ein wichtiger Unterschied ist, dass die Fusion Protein Substrate in diesem Assay-Plattform mit MBP Protein Löslichkeit13 und enthalten ein Steuerelement Spaltstelle TEV PRS ausgestattet sind. Darüber hinaus enthalten die Substrate neue Generation fluoreszierende Proteine, die sind sehr stabil und haben eine Monomere Form Substrat Aggregation zu verhindern. Neben den zuvor veröffentlichten Anwendung des mTurquoise2 und mApple verschmolzen Formen14zeigen hier wir auch, dass Ergebnisse durch den Einsatz eines rekombinanten Substrats mit einem Monomeren fluoreszierende Tag gelb fluoreszierende Protein (mEYFP) erweitert. Hiermit haben wir die Kompatibilität des Systems mit anderen fluoreszierende Proteine zu demonstrieren und vertreten einige allgemeinen Arten von Ergebnissen, die durch die Protease Assays erworben werden können.
Die rekombinanten Fusionsproteinen in E. Coli BL21(DE3) Zellen exprimiert werden und dienen als Substrate für die Probe in einer Nickel-Nitrilotriacetic Säure (Ni-NTA)-magnetisch-Agarose Bead-attached Form beschichtet. Die C-terminale Spaltprodukte werden von der Oberfläche der Perle in der Überstand nach Spaltung durch die Protease des Interesses befreit. Nach der Trennung des Überstands (mit dem Enzym und die Spaltprodukte) von der magnetischen Beads kann die Spaltung Eigenschaften des Enzyms bestimmen die Fluoreszenz gemessen werden. Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Methoden in das hier vorgestellte System basierend auf einer detaillierten Substrat Kalibrierverfahren eindeutig die Mengen an Substrat und C-terminalen Spaltprodukte quantifiziert. Das Testsystem kann durch eine SDS-PAGE-Analyse der Probe Proben unterstützt werden; eine anschließende fluoreszierende in Gel-Visualisierung kann unmittelbar nach der Elektrophorese oder nach in-Gel Renaturierung der nondenatured und denaturierten fluoreszierenden Komponenten, bzw.14angewendet werden.
Die Flexibilität und die Struktur der “Klonen Kassette” erlauben eine Zeit- und kosteneffiziente Einfügung einer Vielzahl von Sequenzen in das Konstrukt und fördert somit die Generation der Substrat-Bibliotheken. Da alle Test-Schritte Automatisierung und HTS-kompatibel sind, kann das System besonders attraktiv für, zum Beispiel werden Protease Spezifität Messungen und Mutagenese Studien oder es auch effektiv für industrielle Protease-Inhibitor-Screening genutzt werden kann und/oder antivirale Medikamentenentwicklung.
Enzym kinetische Parameter (kKatze, Km) können durch die entwickelten Trennung basierende Assays bestimmt werden; Daher kann es einzelne Enzym kinetische Messungen, z. B. den Zeitverlauf, Substrat-abhängige und Hemmung Studien geeignet sein. Dies beweist, dass die rekombinante Fusion Protein Substrate gute Alternativen für die häufig eingesetzten synthetischen Oligopeptid-Substrate bieten, und aufgrund ihrer hohen Ähnlichkeit mit der funkionalen Substrate, sie repräsentieren die natürlich vorkommenden Enzym-Substrat-Interaktionen genauer.
Aufgrund der intensiven industriellen und akademischen Untersuchungen von proteolytischen Enzymen und die ständige Nachfrage für rasche und kostengünstige HTS-kompatiblen Protease Assays Plattformen entsprechend, entwickelten eine magnetische-Perle-basierte fluoreszierende Protease wir Assay. Der Test basiert auf den Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen neuartige Alternativen zu den allgemein verwendeten synthetischen Peptid-Substrate werden können.
Im entwickelten Assay-Format sind die Fusion Protein Substrate an den Oberflächen der Ni-Chelat-beschichtete magnetische Agarose Korne immobilisiert. Die Substrat-Anlage ist durch die N-terminale seine6 Affinität Tag des Fusionsproteins, vorgesehen, die direkt an ein MBP-Tag zur Erleichterung der Faltung und erhöhen die Wasserlöslichkeit der Substrat-13verschmolzen wird. Das MBP folgt Spaltstellen TEV PR und eine Protease von Interesse. Ersteres kann dienen als eine Kontrolle Spaltstelle in der Probe, während letztere durch die Protease untersucht werden verarbeitet werden kann. Die Spaltstelle ist austauschbar; eine kurze DsDNA Sequenz Codierung für die Spaltstelle von Interesse kann in der flexiblen Klonen Kassette des Plasmids Ausdruck durch Unterbindung eingefügt werden. Die rekombinanten Fusionsproteinen enthalten einen hochstabile, Monomere fluoreszierendes Protein-Tag an die C-terminale, wodurch die Endpunkterkennung von dem Enzym befreit, fluoreszierende C-terminale Spaltprodukte frei, worauf proteolytische Spaltung ( Abbildung 1A). Gereinigten fluoreszierende intakt Substrate in verschiedenen Puffer gelöst sind auch für die Kalibrierung verwendet, um die Molaren Konzentrationen der Substrate und Spaltprodukte zu beurteilen. Darüber hinaus können nach Fluorimetry, der Assay-Komponenten durch SDS-PAGE, sowie analysiert werden. Beide Native (nondenatured) und denaturierte fluoreszierende Proteine visualisiert werden im Gel, unmittelbar nach der Elektrophorese oder nach nachfolgenden in Gel Renaturierung bzw.. Diese zusätzliche Verfahren in Kombination mit einer konventionellen Coomassie Brilliant Blue Färbung-Mai werden für die Überprüfung der Untersuchungsergebnisse (Abbildung 1 b) effizient genutzt.
Die Testverfahren besteht aus einfachen, leicht ausführen Schritte in einem Low-Volume-Format, die eine automatische Umgebung mit hohem Durchsatz vollständig angepasst werden können. Allerdings gelten unabhängig von der Durchführung des Tests, entweder manuell oder mit einem Automatisierungssystem, folgende Teile des Tests als entscheidend sein und benötigen besondere Aufmerksamkeit bei der Durchführung des Verfahrens. (i) Homogenität der magnetischen Wulst Lösung. Eine homogene magnetische Wulst-Lösung muss in der gesamten Assay, sowohl in der Reinigung und Waschschritte verwendet werden. Insbesondere hängt die Zuverlässigkeit der Protease Assays richtig Aliquotierung der Stammlösungen Substrat befestigt magnetischer Wulst (SAMB). Um die Wirksamkeit der Aufhängung und Dispersion zu erhöhen, empfiehlt es sich, die Perle-Konzentration zwischen 2 % und 10 % (V/V) festgelegt. Während der Probenvorbereitung, die Verwendung von Puffern ergänzt mit nichtionische Reinigungsmittel (z.B. Triton x-100 oder Tween 20) bis zu 2 % kann auch die Einhaltung der magnetische Beads Kunststoffoberflächen vermindern. Die Einhaltung der Perlen an den Wänden der Probenfläschchen kann vermieden werden, wenn die Perle Suspensionen sorgfältig auf die Böden der Durchstechflaschen statt an den Wänden der Probenröhrchen angewendet werden. Die Homogenität des magnetischen Kügelchen während der enzymatischen Reaktion ist auch kritisch und durch Schütteln kontinuierlich die Proben bei 600 u/min während der Inkubation gewährleistet werden kann. Perlen sind in runden oder flachen Kunststoff waren, richtig verteilt, während der Verwendung von V-Boden-Fläschchen nicht empfohlen wird. Ein suboptimales Ergebnis verursacht durch unsachgemäße Wulst Homogenisierung wird in Abbildung 4 bdargestellt. (II) Beendigung der Reaktion Proben. Ein weiterer Vorteil der Methode ist, dass die enzymatische Reaktion ohne den Einsatz von Denaturierung Wärmebehandlung oder jede potentiell störende chemische Arbeitsstoffe15beendet werden kann. Die Kündigung kann einfach durch die Trennung der magnetischen Beads aus dem Reaktionsgemisch, mit einem herkömmlichen Magnetpartikel Konzentrator erfolgen. Während der entfernten Reaktion Puffer das aktive Enzym und die generierten C-terminale fluoreszierende Spaltprodukte enthält, bleiben die uncleaved Substrate mit Perlen verbunden. Aufgrund des Vorhandenseins von das aktive Enzym im Puffer Reaktion muss das Trennung Verfahren für zuverlässige Endpunkterkennung sorgfältig durchgeführt werden. Vor der Platzierung der Probenfläschchen in der Konzentrator, empfiehlt es sich, eine kurze Drehung Zentrifugation gelten. Nach der Platzierung der Rohre in der Konzentrator bieten mindestens 15 s für die Perlen gesammelt werden. Leichte Bewegung des Separators hin- und Herbewegung kann die Sammlung der Perlen erleichtern. Bitte beachten Sie, dass während eine manuell durchgeführte Trennung der Kündigung in der Regel mehr Zeit als die Einleitung der Reaktionen dauert. Daher wird ein ca. 2 min registriert Verzögerung zwischen den Einweihungen empfohlen, wenn die gleiche Inkubationszeit auf alle Proben angewendet werden muss.
Das Prinzip des beschriebenen proteolytischen Assays ist relativ einfach; die Vielseitigkeit des Systems ist jedoch durch die flexiblen und stabilen Untergrund-Struktur gewährleistet. Individuelle Optimierung des Assays kann nur durch die Kompatibilität der Affinität Perlen mit angewandten Bedingungen, Reagenzien und Zusatzstoffe beschränkt werden. Im Einvernehmen mit der Hersteller-Protokoll fanden wir auch, dass die Affinität Bindung von Substraten, die Ni-NTA-Perle-Oberflächen bei pH ≤ 6,515erheblich schwächt. Daher, es wird empfohlen, Substrat leer Proben parallel zur Reaktion Proben gelten, und die Rate der spontanen Substrat Dissoziation muss bei der Auswertung der Ergebnisse berücksichtigt werden.
In den Fällen, wo magnetische-Perle-basierte Tests durch den Einsatz von Perle-inkompatible Komponenten oder einen niedrigen pH-Wert durchgeführt werden kann, kann auch in Lösung Verdauung der gereinigten rekombinante Substrate angewendet werden. In diesen Fällen die Reaktionsgemischen durch Elektrophorese analysiert werden können, und die Proteine im Gel basierend auf dem beschriebenen Protokoll visualisiert werden können. Um proteolytische Aktivität zu untersuchen, möglicherweise in Lösung Verdauung und in Gel Detektion der Proteine auch alternative Werkzeuge des Fluorimetry. Eine Neuheit des Systems entwickelten Substrat ist die Anwendung eines Schritts in Gel Renaturierung nach denaturierenden SDS-PAGE. Native (nondenatured) fluoreszierende Proteine ihre Fluoreszenz während der Elektrophorese behalten, ist die fluoreszierende Eigenschaft auf Denaturierung (Abb. 7 b) abgeschafft. Die Fluoreszenz von denaturierten Proteinen kann jedoch teilweise durch die Beseitigung der SDS aus dem Gel wiederhergestellt werden. So macht eine Trennung der Reaktionskomponenten mit denaturierenden Bedingungen nicht nur die Fluoreszenz-basierte, sondern die molekularen Gewicht basierende Identifizierung möglich. Ein weiterer Vorteil der Fluoreszenz in-Gel-Detektion im Vergleich zur Analyse eines Gels Coomassie gefärbt ist, dass die (Native oder renaturierte) fluoreszierende Proteine im Gel basierend auf ihre Fluoreszenz leicht identifiziert werden können (siehe Abbildung 7). Dies kann wichtig sein, wenn Spaltung Reaktionen in Proben mit nonfluorescent Verunreinigungen durchgeführt werden oder Proteine die Molmassen von einander sehr ähnlich.
Protease Assays mit ähnlich gestalteten Substrate wurden bereits vorher veröffentlicht8,9,10, und obwohl die Spaltstelle von Interesse in diesen Fällen auch zwischen einer Affinität Tag befand und eine fluoreszierenden Proteins, das Testsystem präsentiert hier wiederholt nicht nur die beschriebenen Ideen aber verbindet die unterschiedlichen Vorteile der bisherigen Plattformen und schließt sie auch mit weiteren Verbesserungen: (i) die Nutzung von einem MBP Fusion Partner, (Ii) die Präsenz ein TEV PR Kontrolle Spaltstelle, Iii) die Nutzung der neu entwickelte Monomeren FPs und iv) die Anwendung eines einzigartigen Substrat Kalibrierung. Der Test selbst wurde speziell für Enzym Spezifität und kinetische Untersuchungen an einem sicheren, Zeit- und kosteneffiziente Art und Weise, ohne die Notwendigkeit für teure Instrumente nützlich. Die Methode zielt darauf ab, einen geeigneten und erschwinglichen Werkzeug für beide industriellen und akademischen Forschungszwecke sein. Aufgrund der Flexibilität der “Klonen Kassette” des Plasmids Ausdruck möglicherweise das System für die schnelle und kostengünstige Erzeugung von rekombinanten Substrat Bibliotheken geeignet. Der hierin beschriebene Test eignet sich für die Umsetzung der Substratspezifität, Enzym Mutagenese, machbar und Hemmung studiert und bieten auch ein alternatives Instrument, um Enzym Kinetik durchführen. Die Assay-Plattform (aus Bakterienzelle Unterbrechungen für die Ermittlung der kinetischen Parameter) kann zu einer HTS – und Automatisierung-basierte Umgebung angepasst werden und gegebenenfalls im industriellen Protease-Inhibitor-Screening und/oder antivirale Medikament angewandt werden Entwicklung. Darüber hinaus ist die Anpassung des Assays für wettbewerbsfähige Proteolyse auch zukünftig Umfang unseres Labors. In solch einem wettbewerbsfähigen Assay verschmolzen zwei verschiedene Substrate-jeder mit einer unterschiedlichen Spaltstelle, a verschiedene C-terminale fluoreszierende Tag-werden gleichzeitig in die gleiche Reaktion der Spaltung um zu untersuchen, die Bevorzugung von den untersuchten verwendet werden sollen Enzym für die gegebenen Ziel-Sequenzen. Darüber hinaus wird die Verwendung einer 96-Well-Platte angepasst-Assay-Form (Abbildung 8) auch für Mutation Screening optimiert durch eine Reihe von Substraten mit modifizierten Spaltung Website Sequenzen bei Cystein-Proteasen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise vom GINOP-2.3.2-15-2016-00044 “teaming PHARMPROT” Project unterstützt und auch, finanziert durch die institutionelle Excellence Hochschulprogramm des Ministeriums der menschlichen Fähigkeiten in Ungarn, im Rahmen der Biotechnologie-thematischen Programm der Universität Debrecen. Die Autoren sind dankbar für die Mitglieder des Labor für Retroviren Biochemie für ihre wissenschaftliche Hilfe während der Assay-Entwicklung und auch für ihre Geduld während der Dreharbeiten der Assay (insbesondere an Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz und Vanda Toldi Wer im Hintergrund des Videos angezeigt werden). Die Autoren möchten auch besonderer Dank Gedeon Richter Plc., vor allem Dr. Zoltán Urbányi dafür, dass Beáta Bozókis Arbeit in der Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie als Gastwissenschaftler sagen. Die Autoren möchten auch ihre Dankbarkeit György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi und Zoltán Király aus dem Multimedia und E-Learning Technical Center der Universität Debrecen für die professionelle Unterstützung im Bereich Audio und Video zu verlängern Produktion.
10K Amicon tubes | Merck-Millipore | UFC501096 | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | M6250 | |
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1 | Bio-Rad | 1610148 | |
Acetic acid | Merck | 100063 | |
Agarose | SERVA | 11404.04 | |
Alpha Imager HP gel documentation system | ProteinSimple | ||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A3678 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | A9518 | |
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge | Beckman Coulter | 392185 | |
Black half-area plates | Greiner bio-One | 675086 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | B0126 | |
CutSmart buffer (10x) | New England Biolabs | B7204S | For plasmid linearization (step 1.1.1) |
Dark Reader transilluminator | Clare Chemical Research | DR-45M | |
DNase I | New England Biolabs | M0303L | |
Dynamag-2 magnetic particle concentrator | Thermo Fischer Scientific | 12321D | |
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | C600003 | |
Ethanol | Merc-Millipore | 100983 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 798681 | |
Gel Loading Dye, Purple (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
Glycerol | Merck | 356350 | |
Glycine | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | G7126 | |
High-Speed Plasmid Mini Kit | GeneAid | PD300 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 56750 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) | AM9464 | |
Jouan CR 412 centrifuge | Jouan | CR412 | |
Labinco LD-76 Rotator | Labinco | 7600 | |
Luria-Bertani (LB) broth | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L3022 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | L6876 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
MERCK eurolab ultrasonic bath | MERCK | USR54H | |
Millifuge Eppendorf spin centrifuge | Millipore | CT10 | |
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell | Bio-Rad | ||
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T9281 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fischer Scientific | ||
NheI-HF restriction endonuclease | New England Biolabs | R3131L | |
Nickel(II) sulfate (NiSO4) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | 656895 | |
Ni-NTA magnetic agarose beads | Qiagen | 36113 | |
Orbital shaker | Biosan | OS-20 | |
PacI restriction endonuclease | New England Biolabs | R0547L | |
PageBlue Protein Staining Solution | Thermo Fischer Scientific | 24620 | |
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P7626 | |
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes | Eppendorf | 22431102 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
Snijders Press-to-Mix shaker | Gemini | 34524 | |
Sodium-acetate trihydrate | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S7670 | |
Sodium-chloride | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S9888 | |
Sodium-hydroxide | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | S5881 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Thermo Fischer Scientific | S7563 | |
T4 DNA ligase | Promega | M180A | |
Thermo shaker | Biosan | TS-100 | with SC-24 accessory block |
Tris | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | T1503 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) | P2287 | |
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter | Wallac Oy, Turku, Finland |