지 베 렐 린 인식 센서 1 (GPS1)는 첫 번째 포스터 공명 에너지 전송 기반 바이오 센서 측정 지 베 렐 린 phytohormones spatiotemporal 고해상도 세포 수준 이다. 이 프로토콜은 시각화 하 고 애기 hypocotyls 및 루트 팁 유전자 인코딩된 nlsGPS1 바이오 센서를 사용 하 여 셀룰러 지 베 렐 린 레벨 계량 방법에 보고 합니다.
Phytohormone 지 베 렐 린 (GA)은 식물에서 씨 발 아, 세포 신장, 및 발달 전환에 중요 한 역할을 재생 하는 작은, 모바일 신호 분자 이다. 지 베 렐 린 인식 센서 1 (GPS1)은 첫 번째 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)-vivo에서 세포가 레벨의 모니터링 수 있는 바이오 센서를 기반으로. 핵 지역화 GPS1 (nlsGPS1)의 형광 방출 비율을 측정 하 여 다른 조직 유형에서 endogenously 및 것 제공 조지아 그라디언트 spatiotemporal 매핑은 세포 수준에서 가능 합니다. 이 프로토콜 3 예제 실험에서 nlsGPS1 방출 비율을 이미지 하는 방법을 설명 합니다: 정상, 전 후 외 인 지 베 렐 린 A4 (GA4) 치료, 그리고 치료 시간 코스. 우리는 또한 nlsGPS1 방출 비율 피지, 상업 3 차원 (3 차원) 현미경 사진 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하 고 제한 및 nlsGPS1를 사용 하 여 지 베 렐 린 수준의 척도 가능성이 함정을 설명 하는 메서드를 제공 합니다.
식물 호르몬은 식물의 성장과 개발에 근본적인 역할을 한다. 이 작은, 모바일 신호 분자는 생 합성, 놓을, 짧은 및 긴 distance 전송1,2,,34등 여러 수준에서 일반적으로 통제 된다. 호르몬 신호 경로 및 다운스트림 transcriptional 응답 이해 년 동안 날카롭게 했다. 그러나, 호르몬 분배를 감독 하는 규제 입력 호르몬 신호 통로의 다양 한 세포질 응답을 연결, 셀룰러 규모 호르몬 수준의 spatiotemporal 정량화를 요구 합니다. 무서 워 기반 바이오 센서 phytohormones를 감지할 수 있는 세포 규모 호르몬 수준을 정할 수 과학자 사전 수 있습니다. 특정 ligand 바인딩 또는 생물 학적 자극에 반응 하는 감각 도메인에 연결 된 무서 워 쌍 (기증자 및 수락자 형광 단백질) 무서 워 기반 바이오 센서에 의하여 이루어져 있다. 작은 분자 바이오 센서에 대 한 ligand 바인딩 방향 무서 워 쌍의 두 가지 형광 단백질 사이의 거리의 변화 귀착되는 감각 영역의 구조적 변화를 트리거합니다. 무서 워 바이오 센서의 비율 분석 기증자 흥분과 기증자5,6이상의 수락자의 형광 방출 비율을 측정 하 여 수행 됩니다. Ligand 바인딩은이 방출 비율7에 변화로 감지입니다.
우리는 최근 식물 호르몬 ga. 가스는 종자 발 아, 세포 신장, 그리고 식물에서 꽃 단계 발달 전환 홍보할 수 있는 호르몬의 클래스에 대 한 무서 워 기반 바이오 센서 개발. NlsGPS1 바이오 센서는 핵 언어와 다양 한 식물 조직에가 역학에 spatiotemporal 통찰력을 제공. 애기 셀에가 녹는 수용 체, 지 베 렐 린을 구분 하지 않는 난쟁이 (GID), 한다 복잡 한 유도 신호2의 부정적인 레 귤 레이 터로 동작 하는 델라 단백질의 저하. 애기 가 수용 체 (AtGID1C) 델라 단백질 (AtGAI)의 74-아미노 산 잘림에 연결 된 nlsGPS1의 조지아 감각 도메인 구성 고 무서 워 쌍의 구성 된 기증자 형광 단백질으로 리안의 이합체 화 변형 및 수락자 형광 단백질8로 아프로디테 (codon 다양 금성). NlsGPS1 바이오 센서는 생리 활성 GA4 에 대 한 높은 선호도 센서 (Kd = 24가4nM) 및 다양 한 조직-종류 지도 및 조지아 그라디언트 계량에 이용 될 수 있다. Vivo에서 애기 가 레벨의 오해를 피하기 위해, 우리는 또한 개발 nlsGPS1의 응답 하지 않습니다 변종 (nlsGPS1-NR) 부정적인 컨트롤로 사용 하. NlsGPS1-NR 단백질 돌연변이 바인딩 주머니에 조지아의 바인딩을 방해 하는 및 GID 수용 체 단백질7,9와 상호 작용을 방해 하는 델라 단백질에 돌연변이 운반 합니다. 방출 비율 패턴 또는 nlsGPS1 및 nlsGPS1 NR 라인에서 변경이 바인딩 이벤트에 직접 관련 된 유물을 간주 수 있습니다. 그것은 또한 조지아4 nlsGPS1 바인딩 하지 빠르게 가역 이며 따라서, 세포 nlsGPS1 방출 비율 대표는 최근 밀집이 주어진된 핵 보다는 실시간으로 해석 되어야 하는 것이 중요 정상 상태 수준입니다. 결과적으로, 떨어지는 레벨의 분석 nlsGPS1와 수는 없습니다.
여기 우리 애기는 고해상도에 confocal 영상 기반 접근을 사용 하 여 모델 식물의 셀에 nlsGPS1 바이오 센서를 이용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 프로토콜 이미징 식물 뿌리와 안정 된 상태에서 및 시간-과정을 통해 hypocotyls에 정보를 제공합니다. 지도 및 조지아 배포판 계량 식물 종에서 뿐만 아니라 다양 한 조직 유형, nlsGPS1 센서를 활용할 수 잠재적으로.
GA 무서 워 기반 바이오 센서 nlsGPS1 보고 및 다세포 식물에 조지아 호르몬 그라디언트를 측정 하는 양적 방법을 제공 합니다. 질량 분석 및 transcriptional 기자 또는 신호 단백질-저하-기반 방법12, 간접 측정 하 여 직접 검색을 통해 향상 된 spatiotemporal 해상도 역학 계량 수 무서 워 기반 바이오 센서 13. 다양 한 조직의 종류에 고해상도 세포 이미징 조지아로 의미 있는 통찰력 규정과 다세포 컨텍스트에서 축적의 기능에 대 한 생물학과 스파크 새로운 가설을 얻을 수 있습니다. 예를 들어 nlsGPS1 바이오 센서 catabolic, 특정가 생 합성 및 전송 돌연변이 뿐만 아니라 spatiotemporally 유발된 물결, 동안에 변화를 모니터링 수 구체적으로 어떻게가 그라디언트는 설립에 테스트를 매우 유익 루트 및 주소 루트 셀 조지아 그라디언트에 대 한 응답. 센서 테스트 씨앗 발 아, 세포 신장, 및 꽃의 GA 중재 컨트롤을 제어 하는 메커니즘의 보존을 다른 모델 및 작물 종에 사용 될 수 있습니다.
NlsGPS1 바이오 센서의 무서 워 기반 영상에서 중요 한 단계는, 1) 픽셀 양적 무서 워 분석 중 포화 하지 해야, “감지기 이득” 2) 이미징 매개 기증자 방출 (DxDm)에 대 한 상수 유지 되어야 한다 고 수락자 방출 (DxAm) 인수, 3) 제어 nlsGPS1 NR 라인 유물, 및 4를 배제 하기 위해 사용 해야 합니다) 샘플 드리프트와 초점 변경 문제를 최소화 하기 위해 준비 되어야 한다. 또한, 샘플 재배 되 고 있는 환경 조건에 이후가 빛 기간 및 빛의 강도14,,1516 같은 환경 조건에 민감한 제어 하는 것이 중요 17. 분석의이 종류의 주요 한계는 높은 신호 대 잡음 비율 영상 잡음 비율 영상에 있는 증가 때문에 필요한입니다. 따라서, nlsGPS1 이미징 조직 및 장기는 청록색과 노란색 형광 단백질을 사용 하 여 비율 형광 현미경 검사 법에 순종 하는 데 유용 되지 것입니다-예를 들어 깊은 조직 형광 단백질 제대로 감지 되었습니다. 다른 한편으로, 비율 정보는 종종 선호 intensiometric 판독을 통해 내부 통제 규칙 유물에 따른 바이오 센서 식, 안정성, 밝기, 또는 주어진된 셀, 조직에에서 여 형태소 분석을 하는 데 도움이 있기 때문에 또는 조건. 예를 들어 바이오 센서 이미징 초조해 하 고 이미지 분석은 또한 조직5,6,,1819,20,의 다양 한 ligands의 다양 한 연구에 이용 되었다. 이미징 실험 및 이미지 분석 여기 보고, 예를 들어 깊은 루트 조직-형식에 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 빛 시트 현미경 같은 새로운 이미징 방법에 맞게 수정할 수 있습니다.
1 세대 nlsGPS1 바이오 센서는 또한 조지아 exogenous 조지아 치료 따르는 세포내 증가에 보고할 수 있는 조지아 그라디언트의 고해상도 지도 제공 하는 높은 선호도 센서입니다. NlsGPS1의 현재 한계 중 하나는 센서는 빠르게 되돌릴 수 및, 따라서, 정상이 레벨에 아니지만, 가능성, 관심의 솔루션에 최대 최근 조지아 농도 보고입니다. 센서에 대 한 정확한 이직 률 이기도 하지 알려진와이, 낮은 가역 결합 일어나 고 있을 수 있습니다 내 생 GA 달콤하게의 감지 하는 걸로 어떤 조직 종류에는 몇 시간 분 이내. 그것은 또한 그 nlsGPS1가4 에 대 한 높은 선호도가지고 주의 하는 것이 중요 (Kd = 24 nM) 다른가 형태에 비해 (GA3 Kd= 240 nM, 조지아1Kd = 110 nM) 다른 생리 활성 가스 이미징 하는 경우 7. 조지아 바이오 센서의 미래 세대는 높은 선호도 유지 하면서 가역을 증가 하거나 다양 한 전조, 생리, 또는 catabolite 가스에 대 한 서로 다른 특이성을 전시 설계 될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (보조금 계약 n ° 759282) 유럽 연구 회의 (ERC)에서 자금을 받고 있다.
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107734 | |
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107735 | |
Gibberellin A4 (GA4) | Sigma | G7276 | dissolve in EtH70 % , and keep at -20°C |
sodium hypochlorite solution (Bleach) | Fisher S/5040 | HSRA 064 | |
Hydrogen cloride HCl | Sigma | 31434 | |
Micropore tape | 3M | 1530-1 | |
ibidi sticky-slide | Ibidi | 81128 | Luer 0.1 for root imaging |
ibidi sticky-slide | Ibidi | 80168 | Luer 0.2 for hypocotyl imaging |
glass coverslip for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
Elbow Luer Connectors | Ibidi | 10802 | |
silicone tubing | Ibidi | 108401 | |
Luer Lock Connector | Ibidi | 10826 | |
programmable syringe pump | World Precision Instruments | AL-1000 | |
Vacuum grease | Sigma | 18405 | |
Murashige and Skoog Basal Salts | Duchefa | M0221 | |
Agar plant, 1kg | Melford | P1001 | |
Microscope slide ground edges, 76mm x 26mm, 1.0mm to 1.2mm thick | Fisher Scientific | 12383118 | |
Cover slip No.1 1/2 glass 22mm x 22mm | Fisher Scientific | 12363138 | |
Luer-slip Syringe 2o ml | Fisher Scientific | 10785126 | |
3M Micropor Surgical Paper Tape | Fisher Scientific | 12787597 | |
Potassium Hydroxide, 500g | Sigma Aldrich | 221473-500G-D | |
Absolute Ethanol | Fisher Scientific | 10428671 | |
Forceps Watchmaker 5 StSteel | Scientific Laboratory Supplies | INS4340 | |
Scissors, 125mm, stainless steel | Fisher Scientific | 12338099 | |
Fitting reducer 0.5 to 1.6 | Ibidi | 10829 | |
Leica SP8 | Confocal laser microscope 1 | ||
Zeiss LSM 780 | Confocal laser microscope 2 | ||
Imaris | Bitplane | 3D visualization and Analysis software | |
Fiji | image analysis software | ||
OriginPro | Origin Lab | Statistical Analysis Software |