Her vi beskriver en metode for å vurdere lunge uttrykk av miRNAs som er spådd for å regulere inflammatorisk gener bruker mus utsatt for ozon eller filtrert luft på ulike stadier av estrous syklusen.
MicroRNA (miRNA) profilering blitt interesse forskerne arbeider i ulike forskningsområder av biologi og medisin. Aktuelle studier viser en lovende fremtid for å bruke miRNAs i diagnostikk og av lungesykdommer. Her definerer vi en protokoll for miRNA profilering for å måle den relative overfloden av en gruppe miRNAs spådd for å regulere inflammatorisk gener i lungevev fra et ozon-indusert airway betennelse mus modell. Fordi det har vist at sirkulerende sex hormonnivået kan påvirke regulering av lunge medfødt immunitet hos kvinner, er formålet med denne metoden å beskrive en inflammatorisk miRNA profilering protokollen i kvinnelige mus, hensyntatt estrous syklusen scenen av hvert dyr samtidig med ozon eksponering. Vi også ta gjeldende bioinformatikk tilnærminger til miRNA oppdagelse og målet identifikasjonsmetoder benytter limma, en R/Bioconductor programvare, og funksjonell analyseprogramvare å forstå biologisk sammenheng og veier knyttet differensial miRNA uttrykk.
microRNAs (miRNAs) er kort (19 til 25 nukleotider), naturlig forekommende, ikke-koding RNA molekyler. Sekvenser av miRNAs er evolusjonære bevart over arter, tyder betydningen av miRNAs i å regulere fysiologiske funksjoner1. microRNA expression profilering har vist seg for å være nyttig for å identifisere miRNAs som er viktige i regulering av en rekke prosesser, inkludert immunforsvar, celledifferensiering, utviklingsprosesser og apoptose2. Nyligere har miRNAs blitt anerkjent for deres mulige bruk i sykdom diagnostikk og therapeutics. For forskere studere mekanismer av genet, kan måle miRNA uttrykk opplyse systemer nivå modeller av regulatoriske prosesser, spesielt når miRNA informasjonen flettes med mRNA profilering og andre genomet-skalaen data3. På den annen side, miRNAs har også vist seg å være mer stabilt enn mRNAs i en rekke prøven typer og er også målbar med større følsomhet enn proteiner4. Dette har ført til betydelig interesse for utvikling av miRNAs som biomarkers for ulike molekylær diagnostiske programmer, inkludert lungesykdommer.
I lungene spille miRNAs viktige roller i utviklingsprosesser og vedlikehold av homeostase. Videre har deres unormale uttrykk vært knyttet til utvikling og progresjon av ulike lungesykdommer5. Inflammatorisk lungesykdommer forårsaket av luftforurensning har vist større alvorlighetsgrad og dårligere prognose i kvinner, som indikerer at hormoner og estrous syklusen kan regulere lunge medfødt immunitet og miRNA uttrykk i reaksjoner på miljørelaterte utfordringer 6. i denne protokollen, bruker vi ozon eksponering, som er en viktig komponent av luftforurensning, for å indusere en form for lungebetennelse i kvinnelige mus som oppstår i fravær av adaptiv immunitet. Ved hjelp av ozon, er vi indusere utviklingen av luftveiene hyperresponsiveness som er tilknyttet airway epithelial celleskader og en økning i nøytrofile og inflammatoriske mediatorer i proksimale airways7. Foreløpig er det ikke godt beskrevet protokoller for å karakterisere og analysere miRNAs over estrous syklusen i ozon-eksponerte mus.
Nedenfor beskriver vi en enkel metode for å identifisere estrous syklus faser og miRNA uttrykk i lungevev av kvinnelige mus utsatt for ozon. Vi også ta effektive bioinformatikk tilnærminger til miRNA oppdagelsen og target identifikasjon, med vekt på beregningsorientert biologi. Vi analyserer microarray dataene med limma, en R/Bioconductor programvare som tilbyr en integrert løsning for å analysere data gen uttrykk eksperimenter8. Analyse av PCR matrisedata fra limma har en fordel i forhold til makt over t-test basert prosedyrer når bruk av matriser/prøver for å sammenligne uttrykk. For å forstå biologisk sammenheng med miRNA uttrykk resultater, brukt vi så funksjonell analyseprogramvare. For å forstå mekanismene regulere transcriptional endringer og forutse sannsynlig utfall, kombinerer programvaren miRNA uttrykk datasett og kunnskap fra litteratur9. Dette er en fordel når sammenlignet med programvare som bare se for statistiske berikelse i overlappende til sett med miRNAs.
MicroRNA profilering er en fordelaktig teknikk for både sykdom diagnose og mekanistisk forskning. I dette manuskriptet definert vi en protokoll for å evaluere uttrykk for miRNAs som er spådd for å regulere inflammatorisk gener i lungene av kvinnelige mus utsatt for ozon i forskjellige estrous syklus faser. Metoder for fastsettelse av estrous syklusen, som visuelle oppdagelse metode, har vært beskrevet16. Men disse avhengige engangs målinger, og derfor er upålitelige. For å nøyaktig identi…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra NIH K01HL133520 (PS) og K12HD055882 (PS). Forfatterne takker Dr. Joanna Floros for hjelp med ozon eksponering eksperimenter.
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
-80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |