Lunge MicroRNA Profiling über the Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung der Lunge Ausdruck von MiRNAs, die vorausgesagt werden, entzündlichen Gene regulieren mit Mäusen Ozon ausgesetzt oder gefilterte Luft in den verschiedenen Phasen des Estrous Zyklus.
Abstract
MicroRNA (MiRNA) Profilerstellung ist von Interesse für Forscher arbeiten in verschiedenen Forschungsgebieten der Biologie und der Medizin geworden. Aktuelle Studien zeigen eine viel versprechende Zukunft der Verwendung von MiRNAs bei der Diagnose und Betreuung von Lungenerkrankungen. Hier definieren wir ein Protokoll für MiRNA profiling um die relative Häufigkeit einer Gruppe von MiRNAs voraussichtlich im Lungengewebe von von einem Mausmodell Ozon-induzierte Atemwege Entzündung entzündlichen Gene regulieren zu messen. Weil sich gezeigt hat, dass zirkulierenden Sexualhormone die Regulierung der angeborenen Immunität Lungenkrebs bei Frauen beeinflussen kann, ist der Zweck dieser Methode zu beschreiben, eine entzündliche MiRNA profiling Protokoll bei weiblichen Mäusen, unter Berücksichtigung des Estrous Zyklus Bühne der einzelnen Tiere zum Zeitpunkt der Ozonbelastung. Wir befassen uns auch geltenden Bioinformatik Ansätze zur MiRNA-Entdeckung und Ziel Identifizierungsmethoden mit Limma, ein R/Bioconductor-Software, und Funktionsanalyse Software zu verstehen, die biologischen Kontext und Wege zugeordnet differenzielle MiRNA Ausdruck.
Introduction
Micro-RNAs (MiRNAs) sind kurze (19 bis 25 Nukleotide), natürlich vorkommende, nicht-kodierende RNA-Moleküle. Sequenzen von MiRNAs sind evolutionär konserviert über Artgrenzen, was auf die Bedeutung der MiRNAs bei der Regulierung der physiologischen Funktionen1. MicroRNA Expression profiling ist nachgewiesen worden, zur Identifizierung von MiRNAs, die wichtig sind bei der Regulierung der eine Vielzahl von Prozessen, einschließlich der Immunantwort, Zelldifferenzierung, Entwicklungsprozesse und Apoptose2hilfreich sein. Vor kurzem wurden MiRNAs für ihre mögliche Verwendung in der Krankheit Diagnostik und Therapie anerkannt. Für Forscher, die Mechanismen der Genregulation kann messen MiRNA Ausdruck aufklären Systemebene Modelle der regulatorischen Prozesse, vor allem beim MiRNA Informationen mit mRNA profiling und andere Genom angelegten Daten3. Auf der anderen Seite MiRNAs haben auch gezeigt, dass stabiler als mRNAs in verschiedensten Probenarten und auch sensibler als Proteine4messbar sind. Dies führte zu erheblichen Interesse an der Entwicklung von MiRNAs als Biomarker für unterschiedliche molekulare diagnostische Anwendungen, einschließlich Lungenerkrankungen.
In der Lunge MiRNAs eine wichtige Rolle in den Entwicklungsprozessen und die Aufrechterhaltung der Homöostase. Darüber hinaus wurde ihre abnormen Ausdruck der Entstehung und Progression von verschiedenen Lungenkrankheiten5zugeordnet. Entzündliche Lungenerkrankungen induziert durch Luftverschmutzung hat gezeigt, mehr schwere und schlechtere Prognose bei Frauen, die darauf hinweist, dass Hormone und den Estrous Zyklus Lunge angeborene Immunität und MiRNA Ausdruck als Reaktion auf ökologische Herausforderungen regulieren können 6. in diesem Protokoll verwenden wir Ozonbelastung, das ist ein wichtiger Bestandteil der Luftverschmutzung, um eine Form der Lungenentzündung bei weiblichen Mäusen zu induzieren, das auftritt, in Ermangelung der adaptiven Immunität. Durch die Verwendung von Ozon, sind wir die Entwicklung der Atemwege Hyperreaktivität induziert, die Atemwege Epithelzelle Schaden und eine Erhöhung der Neutrophilen und Entzündungsmediatoren im proximalen Airways7zugeordnet ist. Derzeit gibt es keine gut beschriebenen Protokolle zu charakterisieren und zu analysieren MiRNAs über den Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt.
Im folgenden beschreiben wir eine einfache Methode zur Ermittlung Estrous Zyklus Phasen und MiRNA Ausdruck im Lungengewebe von weiblichen Mäusen Ozon ausgesetzt. Wir sprechen auch effektive Bioinformatik Ansätze zur MiRNA Entdeckung und Target Identifizierung mit dem Schwerpunkt Bioinformatik. Wir analysieren die Microarray-Daten mithilfe von Limma, eine R/Bioconductor-Software, die eine integrierte Lösung bietet für die Analyse von Daten aus gen Ausdruck Experimente8. Analyse von PCR-Arraydaten aus Limma hat einen Vorteil in Bezug auf Leistung gegenüber t-basierte Testverfahren bei der geringen Anzahl von Arrays/Proben Verwendung Ausdruck zu vergleichen. Um biologische Zusammenhang mit MiRNA Ausdrucksergebnisse zu verstehen, haben wir dann die funktionale Analyse-Software verwendet. Um die Mechanismen zur Regulierung transcriptional Änderungen zu verstehen und wahrscheinlich Ergebnisse vorherzusagen, kombiniert die Software MiRNA-Ausdruck Datasets und wissen aus der Literatur-9. Dies ist ein Vorteil im Vergleich zu Software, die für die statistische Anreicherung in überlappenden Gruppen von MiRNAs schauen.
Protocol
Representative Results
Discussion
MicroRNA profiling ist eine vorteilhafte Technik für Diagnose von Krankheiten und mechanistische Forschung. In dieser Handschrift haben wir definiert ein Protokoll zur Evaluierung des Ausdrucks von MiRNAs, die voraussichtlich entzündlichen Gene in den Lungen von weiblichen Mäusen ausgesetzt Ozon in verschiedenen Estrous Zyklus Stufen regulieren. Methoden zur Bestimmung des Estrous Zyklus, wie die visuelle Erkennungsmethode wurden beschrieben16. Aber diese verlassen sich auf einmalige Messungen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch Zuschüsse vom NIH K01HL133520 (PS) und K12HD055882 (PS) unterstützt. Die Autoren danken für die Unterstützung mit Ozon Belichtung Experimente Dr. Joanna Floros.
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| -80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
References
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