Summary

Sinir kök hücre farklılaşması bir tek adımlı soğuk atmosferik plazma tedavi Vitro tarafından

Published: January 11, 2019
doi:

Summary

Bu iletişim kuralı bir soğuk atmosferik plazma tedavisinin ayrıntılı deneysel adımlar sinir kök hücreleri ve farklılaşma Geliştirme için ayirt algılama sunmayı amaçlamaktadır.

Abstract

Fiziksel plazma teknoloji, soğuk atmosferik plazmasının (CAP) yaygın olarak araştırdık gibi dekontaminasyon, kanser tedavisi, yara iyileşmesi, kök kanal tedavisi, vb, yeni bir araştırma alanı oluşturan plazma tıp adında. Elektrik, kimyasal ve biyolojik reaktif türlerin bir karışımı olarak, kapaklar her iki vitro sinir kök hücre farklılaşması geliştirmek için yeteneklerini göstermiştir ve vivo içinde ve are olma nörolojik hastalık tedavisi için umut verici bir yol gelecekte. Çok daha heyecan verici haber büyük harfler kullanarak tek adımlı farkında olmayabilir ve güvenli bir şekilde yönettiği, sinir kök hücreleri (NSCs) ayrımında doku ulaşım için olduğunu. Biz burada detaylı Deneysel protokol NSC farklılaşma C17.2-NSCs ve birincil sıçan nöral kök hücrelerin, geliştirmek için kendini yetiştirmiş bir kap jet aygıtı kullanarak hem de hücre kaderi ile ters gözlemleyerek ve floresan mikroskopi göstermek. Teknoloji boyama ayirt yardımıyla daha işlenmemiş grubu hızlandırılmış bir Diferansiyel oranı gösterdi her iki NSCs bulduk ve ~ %75-in NSCs seçmeli olarak esas olarak Olgun, kolinerjik ve motor nöronların farklı nöronlar.

Introduction

NSCs yönlendirilmiş farklılaşma doku ulaşım için belirli bir soy içine nörodejeneratif ve neurotraumatic hastalıkları1için en umut verici tedavilerin biri olarak kabul edilir. Örneğin, catecholaminergic dopaminerjik nöron özellikle Parkinson hastalığı (PD) tedavisinde istenen. Ancak, istediğiniz hücreleri taşıma için hazırlamak için geleneksel yöntemlerle kimyasal toksisitesi, yara oluşumu veya büyük ölçüde engellemektedir rejeneratif tıp2NSCs uygulamalarda diğerleri gibi birçok sakıncaları vardır. Bu nedenle, bir roman ve güvenli bir şekilde NSC farklılaşma için bulmak çok gereklidir.

Plazma konularda, aşağıdaki katı, sıvı ve gaz dördüncü durumudur ve bu konularda tüm evrenin % 95’den fazla teşkil eder. Plazma ilişkisiz pozitif/negatif ve tarafsız parçacıkları ile elektriksel olarak nötr ve genellikle yüksek gerilim deşarj Lab tarafından oluşturulur. Son yirmi yılda, biyomedikal plazmada uygulanması soğuk atmosferik basınç plazma teknoloji geliştirme dünya çapında büyük dikkat çekti. Bu teknik sayesinde istikrarlı düşük sıcaklık plazma ark oluşumu olmadan atmosferi çevreleyen havasında oluşturulacak ve reaktif nitrojen türler (RNS), reaktif oksijen türleri (ROS), ultraviyole (UV) gibi çeşitli reaktif türler oluşur radyasyon, elektronlar, iyonlar ve elektrik alanı3. Kapaklar mikro-organizma inactivation, kanser tedavisi, yara iyileşmesi, cilt hastalıkları, hücre çoğalması ve hücre farklılaşması4,5,6,7tedavisi için benzersiz avantajları vardır. Önceki çalışmalarda, biz soğuk atmosferik plazma jet NSCs farklılaşma fare nöral kök hücre C17.2 (C17.2-NSCs) ve birincil sıçan nöral kök hücrelerin, geliştirebilirsiniz yönettiği için güçlü bir araç olmak için büyük bir potansiyele sergilenmesi gösterdi NSCs8farklılaşma. CAP geliştirme NSC farklılaşma mekanizması henüz tam olarak anlaşılmaktadır değil, ancak Hayır kapaklar tarafından oluşturulan sürecinde önemli bir faktör olduğu ortaya çıktı. Bu çalışmada, biz bir atmosfer basıncı helyum/oksijen plazma jeti NSCs vitro, hücre hazırlık ve Önarıtma, morfoloji gözlem tarafından ters mikroskop, tedavisi için kullanmanın ayrıntılı bir deneysel protokol sağlamayı amaçlamaktadır ve floresans mikroskobu gözlem ayirt boyama.

Protocol

1. hücre kültürleri ve Predifferentiation Nöral kök hücre kültür ve predifferentiation Poli-D-lizin-kaplı coverslips hazırlayın. Steril coverslip (20 mm çapında) 12-şey plaka koymak. Poli-D-lizin, % 0,1 w/v, su (Malzemeler tablo) ile kapak cam coverslips üzerinde daha iyi hücre adezyon için sonraki adımları izleyerek kat.Not: Her hücre kültürünü ve uygulama için en uygun koşulları belirlenmelidir. Aseptik poli-D-lizin, % 0,1 w/v…

Representative Results

Hücre morfolojisi ters mikroskop altında her gün kap tedavi sonrasında görülmüştür. Şekil 2 , her iki hücre hatlarında sıradan ters faz kontrastlı ışık mikroskobu görüntüler hücre farklılaşma göstermektedir. Plazma tedavi grubu bir hızlandırılmış farklılaşma oranı ve denetim ve gaz akışı grubuna kıyasla yüksek farklılaşma oranı sergiler. C17….

Discussion

C17.2-NSCs olan bir tür ölümsüzleştirdi nöral kök hücre satırı yenidoğan fare serebellar taneli katman hücrelerden, Snyder ve diğerleri tarafından geliştirilen10,11. C17.2-NSCs nöronlar, astrocytes ve oligodendrocytes ayırabilir ve nörolojik12‘ yaygın olarak kullanılmaktadır. Bizim önceki çalışmada, CAPs C17.2-NSCs farklılaşma nöronların içine geliştirmek. Bir kanıt prensibi çalışma da birincil fare NSCs …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Huazhong Akademik Program, Huazhong Üniversitesi bilim ve teknoloji (No. 2018KFYYXJJ071) ve Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (NOS 31501099 ve 51707012) bağımsız yenilik Fonu tarafından desteklenmiştir.

Materials

Coverslip NEST 801008
Poly-D-lysine Beyotime P0128
DMEM medium HyClone SH30022.01B stored at 4 °C
DMEM/F12 medium HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
N2 supplement Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement Gibco 17504044 stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum HyClone SH30074.03 tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010 stored at 4 °C
Trypsin HyClone 25300054 stored at 4 °C
PBS solution HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
TritonX-100 Sigma T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution Vector Laboratories S-1000-20 stored at 4 °C
anti-Nestin Beyotime AF2215 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III Sigma Aldrich T2200 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4 R&D Systems MAB1326 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG 
12-well plate corning 3512
25 cm2 flask corning 430639
Hoechst 33258 Beyotime C1018 stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium Beyotime P0128 stored at -20 °C and protect from light
Light microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics Company XD-202
Fluorescence microscopy Nikon 80i
High – voltage Power Amplifier Directed Energy PVX-4110
DC power supply Spellman SL1200
Function Generator Aligent  33521A
Oscilloscope Tektronix DPO3034
High voltage probe Tektronix P6015A

References

  1. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
  2. Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
  3. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
  4. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
  5. Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
  6. Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
  7. Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
  8. Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
  9. Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
  10. Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
  11. Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
  12. Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).

Play Video

Cite This Article
Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e58663, doi:10.3791/58663 (2019).

View Video