Este artigo apresenta uma biópsia da glândula mamária bovina usando ferramentas de núcleo e uma agulha de biópsia. Colheita de tecido pode ser usado para cultura de células ou para avaliar a fisiologia mamária e metabolismo, incluindo a expressão de gene, expressão da proteína, modificações de proteína, imuno-histoquímica e as concentrações do metabólito.
Biópsias da glândula mamária bovina permitem aos investigadores coletar amostras de tecido para estudar Biologia celular, incluindo a expressão de gene, análise histológica, sinalização de caminhos e tradução de proteínas. Este artigo descreve duas técnicas para biópsia da glândula mamária bovina (MG). Três saudáveis vacas leiteiras Holstein foram os assuntos. Antes de biópsias, vacas ordenhadas e posteriormente contidas em um para-quedas do gado. Um analgésico (flunixin meglumine, 1,1 a 2,2 mg/kg de peso corporal) foi administrado via jugular venosa prévia de 15-20 min de injeção [IV] para fazer a biópsia. Para sedação em pé, cloridrato de xilazina (0,01-0,05 mg/kg de peso corporal) foi injetado através dos vasos coccígeas 5-10 min antes do procedimento. Uma vez adequadamente sedado, no local da biópsia foi assepticamente preparado e anestesiado localmente com 6 mL de cloridrato de lidocaína a 2%, via subcutânea. Utilizando técnica asséptica, uma incisão vertical de 2 a 3 cm foi feita usando um bisturi número 10. Foram utilizadas ferramentas de núcleo e uma agulha de biópsia. A ferramenta de biópsia do núcleo foi anexada a um berbequim e colocada no tecido MG através da incisão usando uma broca clock-wise ação. A ferramenta de biópsia de agulha foi inserida manualmente no local da incisão. Imediatamente após o procedimento, um assistente aplicar pressão no local da incisão para 20 a 25 min usando uma toalha estéril para obter hemostasia. Grampos cirúrgicos de aço inoxidável foram usados para opor-se a incisão da pele. Os grampos foram removido 10 dias após o procedimento. As principais vantagens das biópsias de núcleo e a agulha é que ambas as abordagens são procedimentos minimamente invasivos que podem ser executados com segurança em vacas saudáveis. Produção de leite após a biópsia não foi afetada. Esses procedimentos exigem um tempo de recuperação curto e resultam em menos riscos de complicações. Limitações específicas podem incluir sangramento após a biópsia e a infecção no local da biopsia. As aplicações destas técnicas incluem coleta de tecido para fins de investigação, tais como a cultura de célula primária e diagnóstico clínico.
A biópsia é um procedimento para colher uma seção do núcleo de tecido do temas para médica ou para fins de pesquisa. É uma técnica minimamente invasiva e amplamente utilizada para coletar o tecido como uma alternativa à eutanásia1 para permitir a análise de respostas teciduais ao tratamento ou outros fatores de interesse. Amostras de tecidos de glândula mamária bovina (MG) são essenciais para lácteos pesquisa estudar a expressão de gene e proteína, histologia, a organização das organelas celulares, sinalização de caminhos e processos metabólicos em resposta a alterações na gestão ou a meio ambiente. Além disso, tecido de MG é necessária para diagnosticar e investigação de determinadas doenças infecciosas, como a mastite bovina causada por infecções bacterianas2.
O úbere de bovinos contém quatro glândulas separadas e cada glândula contém um sistema secretor de leite independente coletivamente chamado parênquima. Os alvéolos, ductos e tecido conjuntivo estão presentes no parênquima mamário. Os alvéolos são estruturas ocas esféricas microscópicas são compostos de células epiteliais na superfície interna (luminal) e mioepiteliais especializadas células na superfície externa (basal). Os alvéolos são responsáveis pela síntese e secreção de leite. O tecido conjuntivo fibroso presente no parênquima pode separar um grupo de alvéolos de outros grupos de alvéolos e cada grupo é chamado um lóbulo3. Vários fatores podem afetar o desenvolvimento e a função do MG, incluindo a fisiologia animal, nutrição, gestão, genética e o ambiente4. Mastite é também um fator crítico que afeta negativamente a MG função e leite de qualidade5. As toxinas liberadas por patógenos mastitic podem causar danos aos alvéolos e induzir necrose resultando em alterações bioquímicas e histológicas no tecido MG6. Assim, a histologia e processos metabólicos de cada alvéolo ou lóbulo na MG podem ser significativamente diferentes dos outros. Como tal, biópsias que são amostras representativas da glândula mamária inteira são desejáveis. Biópsias pequenas podem capturar apenas um único lóbulo ou alvéolos individuais, limitando a informação científica ou diagnóstica resultante. Para fins de investigação, é necessário estar ciente que uma biópsia mamária fornece um ‘instantâneo’ das características do tecido, mas uma biópsia adequadamente não pode caracterizar a função mamária total na ausência de estimativas do total da glândula mamária em massa.
Várias ferramentas de biópsia foram desenvolvidas nos últimos 30 anos para uso humano. Atualmente, adaptações desses instrumentos estão disponíveis para uso com os animais. Para o gado leiteiro, foram obtidas amostras de tecido de MG usando técnicas diferentes, incluindo excisão cirúrgica (dissecção romba)7, biópsia agulhas1,8e núcleo biópsia instrumentos9,10. Assim, técnicas de biópsia MG em vacas leiteiras lactantes têm uma transição de procedimentos usando sedação reclinada com dissecação cirúrgica utilizando eletrocautério hemostasia em 19927 a coleção de biopsias sob permanente sedação9, 10,11,12. Biópsia cirúrgica é um método invasivo, que pode ser caro e têm uma maior incidência de complicações como hematoma, ferida de problemas, e o tumor espalhou13. Atualmente, biopsias e biópsia de agulha (também conhecido como uma biópsia de tru-cut) foram amplamente adotados como alternativas para biópsia cirúrgica. As vantagens do núcleo e agulha biópsias em comparação com a biópsia cirúrgica incluem: o procedimento é minimamente invasivo; as principais complicações são raras; anestesia geral não é necessária; o procedimento é confortavel rápida; o tempo de recuperação é curto; Há um mínimo de efeitos negativo sobre a saúde do úbere e apenas os efeitos a curto prazo em leite rendimento e composição8,9,10; e o custo é de biópsia cirúrgica menos de13.
Um procedimento de biópsia do núcleo descrito em 1996 usado uma estéril, cânula de aço inoxidável com uma lâmina retrátil removível para remover uma quantidade representativa de tecido da MG bovina sem anestesia geral9,10,11 ,12. Durante o procedimento, o instrumento foi anexado a um berbequim para criar uma baixa velocidade, o movimento rotacional que limpa, cortar um núcleo de tecido como a ferramenta foi avançada no tecido. O benefício foi um tecido maior amostra (70 mm x 4 mm de diâmetro, cerca de 0,75 a 1 g) 9. Um recente estudo10 mostrou que o procedimento de biópsia, descrito por V. C. Farret al . 9 pode ser usado para executar repetidas coleções de tecido MG sem o impacto negativo sobre a saúde de desempenho e úbere de vacas em lactação. Mais recentemente, um estudo14 foi realizado em vacas leiteiras para avaliar repetidas biópsias do MG usando um trocarte maior (31 cm longo, exterior diâmetro de 9,5 mm, diâmetro interno de 8 mm) com vácuo aplicado a uma cânula interna de inox para coletar a biópsia . Este método usado (xilazina) de sedação e anestesia local (cloridrato de lidocaína 2%).
A biópsia de agulha é outra técnica para coletar o tecido mamário. Vários estudos têm adotado essa técnica. Um estudo1 usado sedação (detomidine) e anestésico local (lidocaína a 1%) no procedimento. Após a biópsia, as vacas receberam um tratamento antibiótico profilático. A glândula mamária foi massageada manualmente antes e após a ordenha. Sangue no leite foi observado para até 84 h depois da biópsia. A quantidade e a composição do leite foram afetados por um curto período de tempo. Recentemente, um estudo usado uma agulha de biópsia para realizar biópsias repetidas de MG em vacas leiteiras8. (Acepromazina 1%, intramuscular) de sedação e anestesia local (2% cloridrato de lidocaína, subcutânea) foram administrados aos animais. Os animais não receberam drogas intramamárias ou antibióticos antes ou após o procedimento, e não havia sinais de infecção no local da biopsia durante o período pós-cirúrgico. Neste estudo, repetidas biópsias MG bovina, usando uma agulha tinham um menor impacto negativo sobre a saúde de produção e úbere de leite de vacas leiteiras. Em geral, a biópsia de agulha parece ser um método menos invasivo do que o instrumento de biópsia do núcleo. No entanto, conforme observado anteriormente, é essencial para a técnica de biópsia colher uma amostra representativa do tecido MG. A limitação de uma biópsia de agulha é que uma pequena quantidade de tecido bovino de MG é obtida (cerca de 20 a 25 mg)8,15.
Quase todos os estudos usou uma combinação de α-2 agonista sedação e anestesia local8,9,10, se a biópsia foi através de uma agulha ou um núcleo maior. Na espécie bovina MG, a maioria das terminações nervosas estão associadas com a pele. Inervação aos tecidos parenquimatosos é em grande parte através de receptores de estiramento com esparso tipo um fibras nervosas para detectar dor aguda cirúrgica. Como resultado, os mecanismos fisiológicos da dor devido à manipulação cirúrgica do MG é através da pele e tecidos subcutâneos3 e não tecidos tais como tecidos parenquimatosos. Portanto, para procedimentos de biópsia, é apenas necessário anestesiar localmente a pele e tecido subcutâneo, como infiltração de anestésico local em tecidos mais profundos não contribui significativamente para reduzir dor cirúrgica. Após uma preparação adequada da área da biópsia, desconforto animal é, principalmente, associado com moderação.
Coleção de amostras maiores pode aumentar a formação de hematoma e aumentar o risco de infecção dentro do parênquima do MG. Portanto, peri-operatório protocolos geralmente incluem administração de antibióticos parenteral7, embora não seja universais8. Alcançar a hemostasia é também um fator importante para reduzir a morbilidade de vaca. No referido estudo usar um grande núcleo de instrumento de biópsia14, pressão manual aplicou-se para o local da biopsia e um sutiã de vaca foi usado para aplicar gelo para as feridas pelo menos 2h após o procedimento. Apesar da grande quantidade de tecido colhido, observaram-se reduções apenas ligeiras no rendimento de leite e ingestão de alimentos, e o procedimento foi repetido a cada três semanas, sem efeitos negativos sobre a saúde da vaca.
Pesquisadores realizando biópsia MG em vacas leiteiras precisam considerar a qualidade analítica ou diagnóstica da biópsia resultante, facilidade da técnica e a morbidade de vaca. Técnicas cirúrgicas precisas e previamente planejadas são imperativas para atingir esses objetivos. Até à data, estudos de biópsia MG centraram-se em descrever os resultados da biópsia, em oposição a descrever a técnica de biópsia em si, e descrições para vacas leiteiras em lactação faltam pormenor suficiente para permitir a replicação. Assim, o objetivo deste trabalho foi descrever tanto a agulha de biópsia e maiores técnicas de biópsia do núcleo em detalhes suficientes para permitir replicação segura e humana de biópsia MG de gado.
Métodos de biópsia Core e agulha foram descritos no presente protocolo9,16. Uma avaliação detalhada da saúde animal e incidência de mastite14 antes da biópsia é necessária para ambos os procedimentos. Para fins de pesquisa, realizando a técnica em animais com sinais evidentes de inflamação ou doenças infecciosas deve ser evitado. Isso reduzirá o risco de complicações durante e após uma biópsia. Todos os dispositivos e instrumentos de biópsia devem ser limpos, desinfectados e esterilizados para evitar a contaminação do local da biopsia. Antes do procedimento, é necessário minimizar infecções do sítio cirúrgico (SSI). Em geral, a SSI está associada com morbidade animal, perdido desempenho e custos de produção mais elevados em vacas leiteiras. Estudos anteriormente relataram métodos para evitar a SSI devido à biópsia incluindo recorte o cabelo em torno do local da incisão, lavando a área de biópsia para remover contaminação9,14e usando agentes anti-séptico (álcool 70%, iodo cirúrgico Esfregue-se9, de solução de acetato de clorexidina 2%14, 10% de iodo-povidona8) para a preparação da pele. Em alguns estudos, a administração de antibióticos foi adotada durante7 ou imediatamente após a biópsia,9; no entanto, profilaxia antibiótica não foi utilizada no presente trabalho, e não infecções do local da biópsia foram observadas. Para evitar a contaminação da ferida da biópsia, a cauda deve ser protegida para evitar o contato com o local da biópsia até o curativo de aerossol foi aplicado. Neste protocolo, grampos são removidos cerca de 10 a 14 d depois da biópsia.
Antes de uma biópsia do núcleo, é importante para corretamente configurar a ferramenta e anexá-lo para a broca; Escolha uma velocidade de rotação lenta, selecionar a rotação para frente e não use o modo reverso da broca. Durante o procedimento, é importante usar pressão digital em ambos os lados da incisão para separar as bordas de pele e ter uma incisão tempo suficiente para permitir a entrada de ferramenta sem contato com a pele ou tecido conjuntivo. Se este procedimento não é feito, um arrasto sobre as bordas da incisão durante a rotação do instrumento de biópsia do núcleo pode ocorrer e causar trauma de tecido de pele adicional que aumentará o risco de infecção e pode retardar a cicatrização de feridas. Os presentes procedimentos de biópsia descritos neste protocolo foram realizados por um cirurgião credenciado de animais grande. As cirurgias foram realizadas com sucesso (Figura 5). Ambas as técnicas são relativamente fáceis e rápidos para realizar em comparação com o procedimento da excisão cirúrgica.
Sangramento do local da biopsia são comuns após biópsia MG em vacas leiteiras8,9,10,14. No presente protocolo, sangramento observado foi mínimo (Figura 4), que pode ser devido à aplicação de pressão (forte) adequada na ferida imediatamente após o procedimento. Forte pressão pelo menos 20 min é necessária, e pode ser necessária para mais de 30 min, em alguns casos. Se moderada a grave sangramento é observada após a aplicação de pressão para o local da biopsia, é aconselhável continuar a pressão e imediatamente, entre em contato com um veterinário.
Como a hemostasia é um fator importante para reduzir a morbilidade da vaca, um estudo lotaram almofadas hemostáticas no local da biópsia para controle do sangramento9. No entanto, o uso de almofadas hemostáticas de tal forma tem um alto risco potencial de contaminação microbiológica no ambiente de fazenda de gado leiteiro. Outro estudo14 aplicada pressão manual para entre biópsias repetidas e após o encerramento de biópsia e a pele no local da biópsia e aplicado gelo o local pelo menos 2h após a biópsia. No presente protocolo, a forte pressão aplicada no local da biópsia para 20 a 25 min foi adequada para controlar a hemorragia.
Uma técnica bem sucedida biópsia deve resultar em sangue mínimo no leite que persiste por um curto período de tempo após o procedimento. Para evitar a interrupção da secreção de leite durante infecções de decepção e mastite leite, coágulos sanguíneos intramamário devem ser removidos por mão descascar da biopsia trimestre10,14. No presente protocolo, sangue foi observada no leite até 48 h após a biópsia. Entretanto, num estudo que usou um número maior de animais, sangue no leite foi observada na maioria das vacas por menos de 6 dias. Alguns animais apresentaram sangue no leite após 6 dias8. Por esta razão, observação diária de aparência de leite é necessária para 6 d após o procedimento. Animais não apresentam sinais de infecção de mastite quando obteve-se uma amostra de tecido grande14. No entanto, as pesquisas anteriores que realizada biópsias repetidas do mesmo animal, usando uma agulha encontraram que essa incidência de infecção de mastite foi de aproximadamente 12% seguindo o procedimento8. No presente protocolo, nem animal tinha sinais visíveis de infecção de mastite clínica após o procedimento. Há também uma ligeira possibilidade de que o local da incisão pode tornar-se infectado depois da biópsia.
Cloridrato de tolazolina, uma droga que reverte os efeitos de sedação, deve estar disponível no caso de uma overdose de xilazina. Uma dose excessiva de xilazina pode causar edema pulmonar. Os sinais clínicos de edema pulmonar incluem dificuldade respiratória, dispneia grave, dificuldades respiratórias, tosse e expectoração espumosa. Se forem observados sinais de edema pulmonar, é recomendável usar tolazine (2 a 4 mg/kg de peso corporal) para reverter os efeitos de xilazina.
O presente protocolo descreve a técnica para realizar uma biópsia de agulha e biopsias. Em geral, a vantagem de uma biópsia do núcleo em comparação com a biópsia de agulha é o maior de tecido amostra (0,75 a 1 g)9 com mínimo efeito negativo sobre a saúde do úbere. A biópsia de agulha é um método menos invasivo do que o instrumento de biópsia do núcleo. No entanto, biópsia múltiplas tentativas para obter uma maior quantidade de tecido usando que um procedimento de biópsia de agulha pode aumentar o risco de sangramento importante após o procedimento, bem como coágulos de sangue no leite. Ambas as técnicas causaram morbidade mínima de vaca e foram facilmente alcançadas com treinamento mínimo de pessoal cirúrgico. Uma mudança a curto prazo na produção de leite diária (8 a 10% de redução) e sua composição9 e de redução de consumo de ração14 é esperada após os núcleo e agulha biópsias, respectivamente. Limitações do procedimento de biópsia de agulha são o pequeno volume de tecido removido com a agulha. O instrumento precisa ser ativado somente quando a agulha está dentro do tecido a biopsar e várias tentativas, muitas vezes, são necessárias para obter a quantidade adequada de tecido, o que aumenta o risco de sangue no leite e mastite após o procedimento. Limitações da biópsia núcleo incluem um maior risco de sangramento após o procedimento, se uma grande quantidade de tecido (> 200 mg) é obtido. Além disso, a ferramenta de biópsia é mais difícil de montar que exigem treinamento adequado antes do uso.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa nacional de Nutrição Animal e Virginia Tech. A assistência técnica da Sra. Tara Pilonero, Dr. Julie Settlage e Dr. Izabelle Teixeira são reconhecidos com gratidão.
70% Isopropyl alcohol | Walmart | 565106257 | 1 L |
Aerosol spray to kill and repel flies | MWI | 14339 | 1 bottle (if necessary) |
Biopsy needles, 12 G × 16 cm | C. R. Bard | MN1216 | 2 |
Butterfly infusion set (18 G needle) | Fisher | 22-258087 | 1 |
Cell culture dishes | Fisher | 08-772E | 4 |
Cordless drill (low speed) | Hitachi | DS10DFL | 1 |
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) | 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors. | ||
Cows | cattle healthy | ||
Flunixin meglumine | MWI/VetOne | 501018 | 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight |
Folding table | Amazon | 1 | |
Forceps | Fisher | 09-753-50 | 1 |
Gloves non-sterile | Fisher | 17-200-845 | 9, size dependent |
Hard brush | Sullivan Supply | 18270 | 1, to wash the cows |
Head gate | 1, customized for dairy cows | ||
Lidocaine hydrochloride 2% injectable | MWI/VetOne | 510212 | 6 mL was used, from 3 to 8 mL |
Livestock body wash | eZall Technologies | 39384 | 1, to wash the cows |
Needle 18 G (1 to 1/5“) | Fisher | 14-821-15A | 6 |
Needle 20 G (1 to 1/5“) | Fisher | 14-815-526 | 6 |
Phosphate buffered saline (0.9%) | Fisher | 20-012-043 | 1 L |
Povidone Iodine ointment | Jeffers | #VED1A | 500 g (if necessary) |
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) | MWI/VetOne | 510094 | 1 L |
Reusable biopsy instrument | C. R. Bard | MG1522 | 1 |
Rope halter | Nasco farm and ranch | C10852 | 2, cow size |
Scalpel blades (#10) | MWI | 033870 | 2 |
Scalpel holders (#3) | MWI | 602008 | 1 |
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. | Fisher | 19-130-0038 | 1 case of 800 |
Sterile cotton gauze sponges | Fisher | 22-037-986 | 4 |
Sterile gauze pads | Fisher | 19-090-735 | 4 |
Sterile surgical gloves | Surgical gloves | 19-166-679 | 3, size dependent |
Sterile surgical towels | Fisher | 50-118-0339 | 6 |
Stethoscope | Littmann Master Classic II | 1392 | 1 |
Surgical clipper | Oster A5 | 078005-010-003 | 1, preparation of the animal for biopsy |
Surgical clipper blades (#40 ) | Oster | 78919-016 | 1, preparation of the animal for biopsy |
Surgical staple remover | MWI | 541 | 1 |
Surgical stapler pre-loaded | MWI | 17713 | 5 |
Syringes of 10 mL | Fisher | 14-823-224 | 3 |
Syringes of 2 mL | Fisher | 22-028854 | 3 |
Syringes of 20 mL | Fisher | 22-034507 | 3 |
Syringes of 5 mL | Fisher | 22-028855 | 3 |
Thermometer | Agri-Pro Enterprises Inc | 72000 | 1 |
Tolazine hydrochloride | Akorn Animal Health | 61311-486-10 | 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary) |
Tweezer | Fisher | 14-955-025 | 1, for handle the tissue sample |
Water hose | Miracle-Gro, Walmart | 554990501 | 1, to wash the cows |
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) | MWI | 010728 | 1 bottle |
Xylazine hydrochloride | MWI/VetOne | 510650 | 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight |