Dit artikel presenteert een biopsie van de boviene melkklier hulpprogramma’s core en naald biopsie. Geoogste weefsel kan worden gebruikt voor celkweek of borstklier fysiologie en metabolisme met inbegrip van genexpressie, eiwit expressie, eiwit wijzigingen, immunohistochemistry en metaboliet concentraties te beoordelen.
Boviene melkklier biopten kunnen onderzoekers weefselmonsters om te bestuderen van de celbiologie met inbegrip van genexpressie, histologisch analyse, signalering trajecten en eiwit vertaling te verzamelen. Dit artikel beschrijft twee technieken voor biopsie van de boviene melkklier (MG). Drie gezonde Holstein melkkoeien waren de onderwerpen. Voordat biopsieën, waren de koeien gemolken en vervolgens op een vee-parachute gefixeerd. Pijnstiller (flunixin meglumine, 1.1 tot 2,2 mg/kg lichaamsgewicht) werd toegediend via jugular intraveneuze [IV] injectie 15-20 min voorafgaande aan biopsie. Voor staande sedatie, xylazine hydrochloride (0.01-0,05 mg/kg lichaamsgewicht) werd geïnjecteerd via de coccygeal schepen 5-10 min voordat de procedure. Zodra voldoende verdoofd, was de biopsie site aseptisch bereid en lokaal verdoofd met 6 mL 2% lidocaïne hydrochloride via subcutane injectie. Met behulp van aseptische techniek, werd een verticale incisie van 2 tot 3 cm gemaakt met behulp van een scalpel nummer 10. Kern en naald biopsie hulpmiddelen werden gebruikt. Het basisprogramma voor biopsie was gekoppeld aan een cordless drill en ingevoegd in het weefsel van de MG via de incisie met een Clockwise boor-actie. De naald biopsie tool is handmatig ingevoegd in de plaats van de incisie. Onmiddellijk na de ingreep, een assistent toegepast druk op de site van de incisie voor 20 tot 25 min met behulp van een steriele handdoek om hemostase. RVS chirurgische nietjes dienden zich te verzetten tegen de huid incisie. De nietjes waren verwijderd 10 dagen na procedure. De belangrijkste voordelen van core en naald biopsieën is dat beide benaderingen zijn minimaal invasieve procedures die veilig kunnen worden uitgevoerd bij gezonde koeien. Melkopbrengst na de biopsie was onaangetast. Deze procedures vereisen een korte hersteltijd en leiden tot minder risico van complicaties. Specifieke beperkingen kunnen waaronder: bloeden na de biopsie en van besmetting op de site van de biopsie. Toepassingen van deze technieken omvatten weefsel-collectie voor de klinische diagnose en onderzoeksdoeleinden, zoals primaire celculturen.
Een biopsie is een procedure om de oogst een deel van de kern van weefsel van de onderwerpen voor medische of onderzoeksdoeleinden. Het is een minimaal invasieve en meest gebruikte techniek om het verzamelen van weefsel als alternatief voor euthanasie1 zodat de analyse van weefsel reacties op behandeling of andere factoren van belang. Monsters van weefsels van runderen melkklier (MG) zijn essentieel voor zuivel onderzoek te bestuderen van de gen- en eiwit expressie, histologie, de organisatie van cellulaire organellen, signaalroutes en metabole processen in reactie op veranderingen in het beheer of de milieu. Bovendien is MG weefsel nodig voor het opsporen en onderzoeken van bepaalde besmettelijke ziekten, zoals boviene mastitis veroorzaakt door bacteriële infecties2.
De uier van vee bevat vier afzonderlijke klieren en elke klier bevat een onafhankelijke melk secretoire systeem collectief genaamd parenchym. De longblaasjes, buizen en bindweefsel zijn aanwezig in de borstklier parenchym. De longblaasjes zijn microscopische sferische holle structuren die zijn samengesteld uit epitheliale cellen in de binnenkant (luminal) en gespecialiseerde myoepithelial cellen op het buitenoppervlak (basale). De longblaasjes zijn verantwoordelijk voor de synthese en secretie van melk. De vezelig verbindende weefsel aanwezig in de parenchym kan een groep van longblaasjes scheiden van andere groepen van de longblaasjes en elke groep heet een lobule3. Verschillende factoren kunnen invloed op de ontwikkeling en de functie van de met inbegrip van dierlijke fysiologie, voeding, beheer, genetica en de milieu-4MG. Mastitis is ook een kritieke factor die negatief MG functie en melk kwaliteit5 beïnvloedt. De toxinen die zijn vrijgegeven door mastitic pathogenen kunnen leiden tot schade aan de longblaasjes en necrose resulterend in biochemische en histologische veranderingen in het weefsel MG6veroorzaken. Dus, de histologie en metabole processen van elke longblaasjes of lobule in de MG mogelijk beduidend verschillend van anderen. Als zodanig, zijn biopten dat representatieve monsters van de gehele melkklier wenselijk. Kleine biopten kunnen alleen een enkele lobule of individuele alveolus, beperking van de resulterende wetenschappelijke of diagnostische gegevens vastleggen. Voor onderzoeksdoeleinden, is het noodzakelijk zich bewust zijn dat een borstklier biopsie beschikt over een ‘momentopname’ van weefsel kenmerken maar een biopsie kan niet adequaat borstklier functie bij gebrek aan schattingen van de totale melkklier totaal karakteriseren massa.
Verschillende biopsie gereedschappen zijn ontwikkeld in de afgelopen 30 jaar voor menselijk gebruik. Aanpassingen van deze instrumenten zijn momenteel beschikbaar voor gebruik met dieren. Voor melkvee, zijn monsters van MG weefsel verkregen met behulp van verschillende technieken en chirurgische excisie (botte dissectie)7, biopsie naalden1,8, core biopsie instrumenten9,10. Dus, MG biopsie technieken in zogende melkkoeien zijn overgestapt van procedures ligfiets sedatie met chirurgische dissectie gebruiken elektrocauterisatie hemostase in 1992,7 aan collectie van core biopsieën onder staande sedatie9, 10,11,12. Chirurgische biopsie is een invasieve methode, die kan worden duur en hebben een hogere incidentie van complicaties zoals hematoom, wond problemen en tumor verspreid13. Op dit moment zijn kern biopsie en naald biopsie (ook bekend als een tru-cut biopsie) wijd goedgekeurd als alternatieven voor chirurgische biopsie. De voordelen van core en naald biopsieën vergeleken met chirurgische biopsie omvatten: de procedure is minimaal invasieve; grote complicaties zijn zeldzaam; narcose is niet vereist; de procedure is verwant snelle; de hersteltijd is kort; Er is minimale negatieve effecten op de gezondheid van de uier en alleen op korte termijn gevolgen voor melk opbrengst en samenstelling8,9,10; en de kosten is minder dan chirurgische biopsie13.
Een core biopsie beschreven procedure in 1996 gebruikt een steriele, RVS canule met een verwisselbare intrekbaar mes om een representatieve hoeveelheid weefsel van de boviene MG zonder narcose9,10,11 ,12. Tijdens de procedure, werd het instrument vastgemaakt aan een cordless drill maken een lage snelheid, de roterende beweging die netjes een kern van weefsel, gesneden zoals het hulpprogramma was gevorderd in het weefsel. Het voordeel was een grotere weefsel proeven (70 mm x 4 mm diameter, ongeveer 0,75 tot 1 g) 9. Een recente studie10 toonde aan dat de procedure van de biopsie beschreven door V. C. Farret al. 9 kan worden gebruikt voor het uitvoeren van herhaalde MG weefsel collecties zonder negatieve impact op de gezondheid van de prestaties en uier van zogende melkkoeien. Onlangs werd een studie14 uitgevoerd in melkkoeien te beoordelen van herhaalde Biopten van de MG gebruiken een grotere trocar (31 cm lange, buitenste diameter van 9.5 mm, binnendiameter van 8 mm) met vacuüm toegepast op een canule interne roestvrij staal voor het verzamelen van de biopsie . Deze methode gebruikt sedatie (xylazine) en plaatselijke verdoving (2% lidocaïne hydrochloride).
De naald biopsie is een andere techniek voor het verzamelen van de borstklier weefsel. Verschillende studies hebben deze techniek aangenomen. Één studie1 sedatie (detomidine) en plaatselijke verdoving (lidocaïne 1%) in de procedure worden gebruikt. Na de biopsie ontving de koeien een profylactische behandeling met antibiotica. De melkklier was handmatig gemasseerd vóór en na het melken. Bloed in de melk werd waargenomen voor maximaal 84 h na de biopsie. De hoeveelheid en de samenstelling van de melk werden getroffen voor een korte periode van tijd. Onlangs, een studie gebruikt een naald biopsie uit te voeren van herhaalde MG biopsieën in melkkoeien8. Sedatie (1% acepromazine, intramusculaire) en plaatselijke verdoving (2% lidocaïne hydrochloride, subcutaan) werden toegediend aan de dieren. De dieren niet ontving intramammaire drugs of antibiotica vóór of na de ingreep, en er waren geen tekenen van infectie op de site van de biopsie na chirurgische deperiode. In deze studie had herhaalde boviene MG biopsieën met behulp van een naald een klein negatief effect op melk productie en uier gezondheid van melkkoeien. In het algemeen, lijkt de naald biopsie een minder invasieve methode dan de belangrijkste biopsie instrument. Zoals eerder opgemerkt, is het echter essentieel voor de biopsie techniek om te oogsten van een representatieve steekproef van de MG-weefsel. De beperking van een naald biopsie is dat een kleine hoeveelheid boviene MG weefsel wordt verkregen (ongeveer 20 tot 25 mg)8,15.
Bijna alle studies gebruikt een combinatie van α-2 agonist sedatie en plaatselijke verdoving8,9,10, of de biopsie via een naald of een grotere kern was. In de boviene MG worden de meeste zenuwuiteinden geassocieerd met de huid. Innervatie van de arm aan het parenchymal weefsel is grotendeels via stretch receptoren met sparse Type een zenuwvezels te detecteren scherpe chirurgische pijn. Dientengevolge is de fysiologische mechanismen van pijn als gevolg van chirurgische manipulatie van de MG via huid en subcutane weefsels3 en niet diepe weefsels zoals parenchymal weefsel. Daarom voor biopsie procedures is het alleen nodig om lokaal anesthetize van de huid en de subcutane weefsels, zoals infiltratie van lokale verdoving in de diepere weefsels chirurgische pijn niet aanzienlijk vermindert. Na een passende voorbereiding van de biopsie gebied, dierlijke ongemak is, voornamelijk, terughoudendheid is gekoppeld.
Grotere kern monsters kan verhogen hematoom vorming en verhogen het risico van besmetting binnen het parenchym MG. Peri-operatieve protocollen bevatten daarom vaak toediening van parenterale antibiotica7, hoewel dat niet Universalia8. Het bereiken van hemostase is ook een belangrijke factor voor de vermindering van de morbiditeit van de koe. In de bovengenoemde studie met behulp van een grote kern biopsie instrument14, manuele druk werd toegepast op de site van de biopsie en een koe beha werd gebruikt om het ijs op de wonden voor ten minste 2 uur volgens de procedure van toepassing. Ondanks de grote hoeveelheid weefsel geoogst, slechts in geringe mate reducties in diervoeders inname en melk opbrengst werden waargenomen, en de procedure elke drie weken zonder negatieve effecten op de gezondheid van de koeien werd herhaald.
Onderzoekers MG biopsie uitvoeren in melkkoeien moeten nadenken over de diagnostische of analytische kwaliteit van de resulterende biopsie, gemak van techniek en koe morbiditeit. Nauwkeurige en vooraf geplande chirurgische technieken zijn noodzakelijk om deze doelen te bereiken. Tot op heden MG biopsie studies hebben gericht op het beschrijven van de resultaten van de biopsie, in tegenstelling tot het beschrijven van de techniek van de biopsie zelf, en beschrijvingen voor zogende melkkoeien gebrek aan voldoende gedetailleerd zijn om replicatie mogelijk te. Dus, het doel van dit werk was zowel naald biopsie en grotere kern biopsie technieken voldoende gedetailleerd zijn om veilige en humane replicatie van MG biopsie van vee mogelijk te beschrijven.
Kern en naald biopsie methoden werden beschreven in dit protocol9,16. Een gedetailleerde evaluatie van de diergezondheid en de incidentie van mastitis14 vóór de biopsie is vereist voor beide procedures. Voor onderzoeksdoeleinden, moet uitvoeren van de techniek in dieren met duidelijke tekenen van ontsteking of besmettelijke ziekten worden vermeden. Dit zal het risico van complicaties tijdens en na een biopsie. Alle biopsie instrumenten en apparaten moet schoon, ontsmet en gesteriliseerd om verontreiniging van de biopsie site te voorkomen. Voordat de procedure is het noodzakelijk om te minimaliseren van de chirurgische site infecties (SSI). In het algemeen, wordt SSI geassocieerd met dierlijke morbiditeit, verloren prestaties en hogere productiekosten in melkkoeien. Studies gerapporteerd eerder methoden ter voorkoming van SSI als gevolg van de biopsie inclusief knippen van de haren rond de site van de incisie, wassen van de biopsie gebied als u wilt verwijderen van verontreiniging9,14, en het gebruik van antiseptische agenten (70% alcohol, jodium chirurgische schrobben9, 2% chloorhexidine acetaat oplossing14, 10% Povidon-jodium8) voor de voorbereiding van de huid. In sommige studies, werd toediening van antibiotica aangenomen tijdens de7 of onmiddellijk na de biopsie9; echter antibiotica profylaxe werd niet gebruikt in het huidige werk, en geen infecties van de biopsie site werden waargenomen. Om te voorkomen dat besmetting van de biopsie wond, moet de staart worden beveiligd om te voorkomen dat contact met de biopsie site totdat de aërosol bandage is vereffend. In dit protocol worden nietjes ongeveer 10 tot en met 14 d verwijderd na de biopsie.
Voorafgaand aan een biopsie van de kern is het belangrijk om goed de tool instellen en deze koppelen aan de boor; kiezen van een langzame rotatiesnelheid, de voorwaartse rotatie en gebruik niet de omgekeerde modus van de boor. Tijdens de procedure is het belangrijk met digitale druk aan beide zijden van de snede te houden de huid randen apart en hebben een lang genoeg incisie voor het gereedschap invoeren zonder het contact met de huid of bindweefsel. Als deze procedure niet wordt gedaan, kan een belemmering voor de randen van de incisie tijdens rotatie van het instrument van de biopsie kern optreden en veroorzaken extra huid weefseltrauma die vergroot het risico van infectie en kan onmiddellijk wondgenezing. De huidige biopsie procedures beschreven in dit protocol werden uitgevoerd door een board-gecertificeerde grote dierlijke chirurg. De procedures werden met succes uitgevoerd (Figuur 5). Beide technieken zijn relatief gemakkelijk en snel uit te voeren ten opzichte van de chirurgische excisie procedure.
Bloeden uit de biopsie site gelden na MG biopsie in melkkoeien8,9,10,14. In het huidige protocol, bloeden waargenomen was minimaal (Figuur 4), die kan worden veroorzaakt door de toepassing van adequate (sterk) druk op de wond onmiddellijk na de ingreep. Sterke druk gedurende ten minste 20 minuten is vereist, en het nodig kan zijn voor meer dan 30 min in sommige gevallen. Matige tot ernstige bloeding wordt waargenomen na toepassing van druk op de site van de biopsie, wordt het aanbevolen om als blijven druk, en onmiddellijk contact op met een dierenarts.
Zoals hemostase een belangrijke factor is voor de vermindering van de morbiditeit van de koe, verpakt een studie hemostatische pads in de site van de biopsie bepalen bloeden9. Gebruik voor hemostatische pads op zodanige wijze heeft echter een hoog potentieel risico voor de microbiologische verontreiniging in de omgeving van de melkveehouderij. Een andere studie14 handmatige druk toegepast op de site van de biopsie tussen herhaalde biopsieën en na biopsie en huid kunnen worden afgesloten, en ijs op de site gedurende minstens 2 uur na de biopsie toegepast. In het huidige protocol was sterke druk uitgeoefend op de site van de biopsie voor 20 tot 25 min voldoende om te controleren bloeden.
Minimale bloed in de melk die langer voor een korte periode na de ingreep aanhoudt moet leiden tot een succesvolle biopsie techniek. Om te voorkomen dat een onderbreking van de secretie van melk tijdens melk teleurstelling en mastitis infecties, moeten intramammaire bloedklonters worden verwijderd met de hand strippen van de biopsied kwartaal10,14. In het huidige protocol, werd bloed waargenomen in de melk tot 48 uur na de biopsie. Echter, in een studie waarmee een groter aantal dieren, bloed in de melk werd waargenomen in de meerderheid van de koeien minder dan 6 dagen. Enkele dieren bleek bloed in de melk na 6 dagen8. Om deze reden is dagelijkse observatie van melk verschijning noodzakelijk voor 6 d na de ingreep. Dieren deed niet vertonen tekenen van mastitis infectie wanneer een grote weefsel monster14was verkregen. Echter vond vorige onderzoek dat herhaalde biopsieën uitgevoerd op hetzelfde dier met behulp van een naald dat die mastitis infectie incidentie was ongeveer 12% na de procedure8. In het huidige protocol had noch dier visuele tekenen van klinische mastitis infectie na de ingreep. Er is ook een kleine kans dat de insnijding site na de biopsie besmet kan raken.
Tolazoline hydrochloride, een drug die de effecten van sedatie keert, moet beschikbaar zijn in het geval van een overdosis van xylazine. Een hoge dosis xylazine kan longoedeem veroorzaken. Klinische symptomen van longoedeem omvatten respiratoire nood, ernstige kortademigheid, ademhalingsproblemen, hoesten en schuimend sputum. Symptomen van longoedeem zijn waargenomen, wordt het aanbevolen om als tolazine (2 tot 4 mg/kg lichaamsgewicht) gebruikt om te keren van de effecten van de xylazine.
Dit protocol beschrijft de techniek voor het uitvoeren van zowel een naald biopsie en core biopsie. Het voordeel van een biopsie van de kern ten opzichte van de naald biopsie is in het algemeen, de grotere weefsel monster (0,75 tot 1 g)9 met minimale negatief effect op de gezondheid van de uier. De naald biopsie is een minder invasieve methode dan de belangrijkste biopsie instrument. Echter meerdere biopsie geprobeerd te verkrijgen van een grotere hoeveelheid weefsel met behulp van die een naald biopsie procedure het risico verhogen kan van grote bloeden na de procedure, alsmede de bloedstolsels in de melk. Beide technieken minimale koe morbiditeit veroorzaakt en waren gemakkelijk bereikt met minimale opleiding van chirurgische personeel. Een korte termijn verandering in dagelijkse melkopbrengst (8 tot 10% afname) en haar samenstelling9 en voeropname vermindering van14 naar verwachting na de kern en naald biopsieën, respectievelijk. Beperkingen van de naald biopsie procedure zijn het kleine volume van weefsel verwijderd met de naald. Het instrument moet worden geactiveerd, alleen wanneer de naald binnen het weefsel is als biopsied en vaak meerdere pogingen nodig zijn om voldoende hoeveelheden weefsel, dat het risico van bloed in de melk en mastitis na de ingreep verhoogt. Beperkingen van de kern biopsie omvatten een hoger risico van bloeden na de ingreep als een grote hoeveelheid weefsel (> 200 mg) wordt verkregen. Bovendien, is de biopsie tool moeilijker te monteren vereisen adequate opleiding vóór gebruik.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door de nationale Animal Nutrition Program en Virginia Tech. De technische bijstand van Ms. Tara Pilonero, Dr. Julie Settlage en Dr. Izabelle Teixeira dankbaar zijn erkend.
70% Isopropyl alcohol | Walmart | 565106257 | 1 L |
Aerosol spray to kill and repel flies | MWI | 14339 | 1 bottle (if necessary) |
Biopsy needles, 12 G × 16 cm | C. R. Bard | MN1216 | 2 |
Butterfly infusion set (18 G needle) | Fisher | 22-258087 | 1 |
Cell culture dishes | Fisher | 08-772E | 4 |
Cordless drill (low speed) | Hitachi | DS10DFL | 1 |
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) | 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors. | ||
Cows | cattle healthy | ||
Flunixin meglumine | MWI/VetOne | 501018 | 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight |
Folding table | Amazon | 1 | |
Forceps | Fisher | 09-753-50 | 1 |
Gloves non-sterile | Fisher | 17-200-845 | 9, size dependent |
Hard brush | Sullivan Supply | 18270 | 1, to wash the cows |
Head gate | 1, customized for dairy cows | ||
Lidocaine hydrochloride 2% injectable | MWI/VetOne | 510212 | 6 mL was used, from 3 to 8 mL |
Livestock body wash | eZall Technologies | 39384 | 1, to wash the cows |
Needle 18 G (1 to 1/5“) | Fisher | 14-821-15A | 6 |
Needle 20 G (1 to 1/5“) | Fisher | 14-815-526 | 6 |
Phosphate buffered saline (0.9%) | Fisher | 20-012-043 | 1 L |
Povidone Iodine ointment | Jeffers | #VED1A | 500 g (if necessary) |
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) | MWI/VetOne | 510094 | 1 L |
Reusable biopsy instrument | C. R. Bard | MG1522 | 1 |
Rope halter | Nasco farm and ranch | C10852 | 2, cow size |
Scalpel blades (#10) | MWI | 033870 | 2 |
Scalpel holders (#3) | MWI | 602008 | 1 |
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. | Fisher | 19-130-0038 | 1 case of 800 |
Sterile cotton gauze sponges | Fisher | 22-037-986 | 4 |
Sterile gauze pads | Fisher | 19-090-735 | 4 |
Sterile surgical gloves | Surgical gloves | 19-166-679 | 3, size dependent |
Sterile surgical towels | Fisher | 50-118-0339 | 6 |
Stethoscope | Littmann Master Classic II | 1392 | 1 |
Surgical clipper | Oster A5 | 078005-010-003 | 1, preparation of the animal for biopsy |
Surgical clipper blades (#40 ) | Oster | 78919-016 | 1, preparation of the animal for biopsy |
Surgical staple remover | MWI | 541 | 1 |
Surgical stapler pre-loaded | MWI | 17713 | 5 |
Syringes of 10 mL | Fisher | 14-823-224 | 3 |
Syringes of 2 mL | Fisher | 22-028854 | 3 |
Syringes of 20 mL | Fisher | 22-034507 | 3 |
Syringes of 5 mL | Fisher | 22-028855 | 3 |
Thermometer | Agri-Pro Enterprises Inc | 72000 | 1 |
Tolazine hydrochloride | Akorn Animal Health | 61311-486-10 | 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary) |
Tweezer | Fisher | 14-955-025 | 1, for handle the tissue sample |
Water hose | Miracle-Gro, Walmart | 554990501 | 1, to wash the cows |
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) | MWI | 010728 | 1 bottle |
Xylazine hydrochloride | MWI/VetOne | 510650 | 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight |