Summary

コナガからのリアノジン受容体の N 末端ドメインの結晶構造

Published: November 30, 2018
doi:

Summary

この記事で私たちはコナガ (コナガ) からリアノジン受容体の N 末端ドメインの蛋白質の発現、精製、結晶化、構造決定のプロトコルを説明します。

Abstract

強力かつ効率的な農薬の昆虫リアノジン受容体 (RyRs) をターゲットとして開発されている農業害虫コントロールの領域に大きな関心。日付、著者殺虫 RyRs が製品化されている害虫を対象、20 億ドルの年間売り上げ高を生成します。RyR を対象とした殺虫剤の作用のモードの理解は昆虫 RyR に関する構造情報の不足によって制限されます。これは順番の害虫に殺虫剤抵抗性の発達の理解を制限します。コナガ (DBM) は、著者の殺虫剤に抵抗性を示すことも報告されている世界、アブラナ科作物を破壊する壊滅的な害虫です。したがって、それは DBM RyR、特に伝統的な著者の結合部位とは異なる地域をターゲットをターゲット新しい殺虫剤を開発する非常に実用的な重要なのです。構造的に特徴付ける DBM から RyR の N 末端ドメイン プロトコルを紹介します。X 線結晶構造の解像度で分子の交換によって解決された Å、2.84 のベータ トレフォイル折りたたみモチーフと並ぶ α ヘリックスを示しています。このプロトコルは一般的に式、浄化および他のドメインまたは蛋白質の構造解析の合わせることができます。

Introduction

リアノジン受容体 (RyRs) は、特定のイオン チャンネルは、筋細胞の筋小胞体 (SR) 膜を渡る Ca2 +イオンの透過を仲介します。したがって、彼らはプロセスを結合励起収縮に重要な役割を果たします。その機能の形で RyR 分子質量とホモ四量体としてアセンブル > 2 MDa、各サブユニットから成る 〜 5000 アミノ酸残基と。哺乳類では、3 つのアイソ フォーム: RyR1 – 骨格筋型、RyR2-心筋型および RyR3-普遍的組織1で表されます。

昆虫は、筋肉や神経組織2で表現される RyR の 1 種類のみです。昆虫 RyR は約 47% のシーケンス id を持つ哺乳類 RyR2 に似て3。RyR 鱗翅目や鞘翅目のターゲット著者殺虫剤を開発し、バイエル (フルベンジアミド)、デュポン (chlorantraniliprole)、シンジェンタ (cyantraniliprole) のような主要な企業によって販売されています。比較的最近の発売以来、著者殺虫剤は殺虫剤の急成長しているクラスの一つなっています。現在、これらの 3 つの殺虫剤は年間の売り上げ高は、2009 年 (Agranova) 以来 50% 以上の成長率で 20 億米ドルを越えています。

最近の研究では、これら殺虫剤4,5,6,7,8の使用法の数世代後の昆虫の抵抗の開発を報告しています。抵抗膜貫通ドメインの変異 RyRs コナガ (DBM)、コナガ(G4946E、I4790M) およびトマト マメハモグリバエに対応する位置から、このトゥタ(G4903E、I4746M) 領域を表示します。この地域はチャネル4,8,9のゲートのために重要であること知られている著者の殺虫剤の結合に関与するかもしれない。この分野で広範な研究にもかかわらず著者殺虫剤の正確な分子メカニズムはとらえどころのないままです。また、耐性変異がジアミドとの相互作用に影響するかどうか、直接またはアロステリックはクリアです。

以前の研究は、哺乳類からいくつかの RyR ドメインの構造と x 線結晶構造解析と電子顕微鏡で、それぞれ1011、フルレングスの哺乳類 RyR1 と RyR2 の構造を報告しています。 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21.しかし、これまでのところ、昆虫 RyR の構造が報告されていない、受容体機能の分子の複雑さと同様、殺虫剤作用分子機序と殺虫剤抵抗性の発達を理解することから私たちを禁止します。

本稿では、コナガ、アブラナ科作物の世界22に感染する破壊的な害虫からリアノジン受容体の N 末端 β トレフォイル ドメインの構造特性の一般化されたプロトコルを提案する.公開されたウサギ RyR1 NTD 結晶構造23,24と低温電子顕微鏡構造モデル16,17,18,19,によると設計された構造20,21。 これは最初の高分解能構造昆虫 RyR チャネルの開閉機構を明らかにし、構造基づかせていた薬剤の設計を使用して特異的殺虫剤の開発の重要なテンプレートが提供するために報告します。構造解明のため近くの原子分解能での蛋白質の構造の決定の「ゴールド スタンダード」として考慮される x 線結晶解析を採用。結晶化プロセスは予測不可能な労働集約的なこのステップバイ ステップのプロトコルはエクスプレス、浄化し、一般的に昆虫 RyR または他の蛋白質の他のドメインを特徴づける研究者に役立ちます。

Protocol

1. 遺伝子クローニング、タンパク質の発現と精製 PCR の興味の蛋白質に対応する DNA を増幅 (DBM RyR、Genbank の残留 1 205 なし準拠。AFW97408) と結紮独立クローン (LIC)25ペット 28 a HMT ベクターにクローン。このベクトルには、ヒスチジンの札には、MBP タグには N 末端の TEV プロテアーゼ切断部位が含まれています15 。 LIC LIC 互換 5′ 拡張…

Representative Results

浄化 DBM RyR の N 末端ドメインは、hexahistidine タグ、MBP タグ TEV プロテアーゼ切断部位との融合蛋白質として表現されました。我々 は、結晶化の目的に適した高純度のタンパク質を得るために 5 つのステップ浄化戦略を追った。最初は、融合タンパク質は、Ni NTA 列 (HisTrap HP) によって細胞ライセートの可溶性画分から精製した…

Discussion

本稿では recombinantly エクスプレス、浄化、結晶化、DBM RyR NTD の構造を決定する手順をについて説明します。結晶化の重要な要件は、高溶解性、純度、均一性タンパク質を得ることです。プロトコル、hexahistidine タグとより高い倍純度を取得する浄化に利用できるどちらの MBP タグが含まれているペット 28 a HMT ベクターを使用にしました。さらに、MBP タグがターゲット蛋白質の溶解度で補助さ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究によって提供された資金: キー研究と開発中国プログラムの (2017YFD0201400、2017YFD0201403)、国家自然科学基金、中国の (31320103922、31230061) との国民基礎研究プロジェクト (973) プログラム中国 (2015CB856500、2015CB856504)。ビームライン BL17U1 上海シンクロトロン放射光施設 (SSRF) でスタッフに感謝しております。

Materials

pET-28a-HMT vector This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain Novagen 69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL) GE Healthcare 45-000-325
Amylose resin column New England Biolabs E8021S
Q Sepharose high-performance column  GE Healthcare 17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO) Millipore UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column  GE Healthcare 28-9893-36
Automated liquid handling robotic system  Art Robbins Instruments Gryphon
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 82050-494
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601
Mounted CryoLoop – 20 micron Hampton Research HR4-955
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607
Nano drop Thermo Scientific NanoDrop One
Crystal incubator Molecular Dimensions MD5-605
X-Ray diffractor Rigaku FRX
PCR machine Eppendorf Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit Qiagen 27104
Gel extraction kit Qiagen 28704
SspI restriction endonuclease NEB R0132S
T4 DNA polymerase Novagen 2868713
Kanamycin Scientific Chemical 25389940
IPTG Genview 367931
HEPES Genview 7365459
β-mercaptoethanol Genview 60242
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall LYNX 6000 
Sonnicator Scientz II-D
Protein purification system GE Healthcare Akta Pure
Light microscope Nikon SMZ745
IzIt crystal dye Hampton Research HR4-710
Electrophoresis unit Bio-Rad 1658005EDU
Shaker Incubator Zhicheng ZWYR-D2401
Index crystal screen Hampton Research HR2-144
Structure crystal screen Molecular Dimensions MD1-01
ProPlex crystal screen Molecular Dimensions MD1-38
PACT premier crystal screen Molecular Dimensions MD1-29
JCSG-plus crystal screen Molecular Dimensions MD1-37

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Cite This Article
Nayak, B. C., Wang, J., Lin, L., He, W., You, M., Yuchi, Z. Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella. J. Vis. Exp. (141), e58568, doi:10.3791/58568 (2018).

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