Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione di fette di agarosio-riempito umano del polmone di taglio di precisione da tessuto resecato del paziente che sono adatti per la generazione di colture di tessuti del polmone 3D per malattie polmonari umane modello negli studi biologici e biomedici.
Traduzione del romanzo scoperte alla malattia umana è limitata dalla disponibilità di modelli basati su tessuto umani della malattia. Fette di taglio di precisione del polmone (tributo) utilizzati come colture del tessuto polmonare 3D (3D-LTC) rappresentano un elegante e modello della coltura cellulare 3D biologicamente molto rilevante, che assomigliano a altamente in situ tessuto a causa della loro complessità, biomeccanica e molecolari composizione. Affettare del tessuto è ampiamente applicata in vari modelli animali. 3D-LTC derivato dal tributo umano può essere utilizzato per analizzare le risposte a nuovi farmaci, che potrebbero ulteriormente aiutare a comprendere meglio i meccanismi e gli effetti funzionali delle droghe nel tessuto umano. La preparazione del tributo da campioni di tessuto chirurgicamente resecata del polmone di pazienti, che hanno avvertito la lobectomia polmonare, aumenta l’accessibilità di malati e tessuto peritumorale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione di tributo umano dal tessuto chirurgicamente resecato elastico morbido paziente polmonare. Dell’agarosi è stato introdotto nello spazio broncoalveolare di resectates, così conservando la struttura del polmone e aumentando la rigidità del tessuto, che è cruciale per affettare successive. 500 µm spessore fette sono state preparate dal blocco di tessuto con un vibratomo. Pugni di biopsia prelevati da tributo garantiscono paragonabile tessuto dimensioni del campione e aumentano ulteriormente la quantità di campioni di tessuto. Le colture di tessuto polmonare generato può essere applicate in una varietà di studi di biologia del polmone umano, tra cui la patofisiologia e meccanismi di diverse malattie, quali processi fibrotici ai suoi livelli cellulari migliori alle (sub-). Il vantaggio più alto del 3D-LTC ex vivo modello è la sua rappresentazione stretta del polmone umano in loco per quanto riguarda l’architettura del tessuto 3D, diversità del tipo di cellula e anatomia del polmone, nonché il potenziale per la valutazione del tessuto da singoli pazienti, che è rilevante per sviluppare nuove strategie per la medicina di precisione.
Malattie polmonari acute e croniche sono una causa importante di morbilità e mortalità in tutto il mondo1. Per i pazienti con malattie polmonari croniche come broncopneumopatia ostruttiva (BPCO)2, asma grave3, polmone cancro4 e diffusa del parenchima polmonare malattie5, terapie curative non sono attualmente disponibili. Sebbene studi in modelli animali di malattie polmonari hanno approfondito la comprensione della malattia pathomechanisms6 ed hanno portato all’identificazione di potenziali nuovi bersagli terapeutici7,8,9, questi modelli presentano rilevanti differenze biologiche e fisiologiche rispetto per gli esseri umani10. Per superare queste discrepanze fra biologia murina ed umana così come anatomia, umano ex vivo 3D polmonare coltura tissutale (3D-LTC) sistemi sono utilizzati in vari settori della ricerca biomedica. Questi sistemi di coltura di 3D-LTC si basano sulle fette di taglio di precisione del polmone (tributo). La generazione di tributo ex vivo permette l’analisi di una terza dimensionalità spaziale, che consente per l’indagine dei rapporti spaziali e funzionali delle cellule in intero alveoli e airways11, come pure l’interstizio, sistema vascolare e mesotelio. In particolare, tributo modelli ex vivo è pluricellulari, che significa che essi contengono cellule più funzionale dei polmoni in situ, così strettamente che rappresenta nativo ambiente biologico delle cellule e superando così il limitato cellula-cellula e interazione cellula-matrice in maggior parte 2D si avvicina la coltura delle cellule. Fino ad ora, ex vivo murino tributo sono stati utilizzati per modellare le malattie polmonari, come BPCO12, di fibrosi polmonare13, polmone cancro14, infezione virale15,16, di displasia broncopolmonare17, e asma18. Tuttavia, una parte considerevole delle terapie farmacologiche romanzo nelle malattie polmonari umane che sono state studiate in studi clinici non si traducono in clinica a causa della loro mancanza di efficacia o di sicurezza, assumingly a causa ancora notevoli differenze tra uomo e murino biologia e malattia19,20,21.
In parecchi anni, tributo umano è stati in gran parte utilizzati per valutare la tossicità polmonare di sostanze chimiche e farmaci. Solo recentemente, tessuto polmonare umano è stato utilizzato dai pazienti con COPD22,23, asma24e di fibrosi polmonare25, a perseguire studi fisiopatologici e farmacologici. Utilizzando materiale resecato organo paziente e generazione di tributo, uno può ricapitolare le caratteristiche importanti della malattia in un complesso tessuto 3D ambiente22 che rappresenta e mantenendo la maggior parte della diversità cellulare nativa dell’organo. Inoltre, il tessuto malato applicato in una varietà di configurazioni sperimentali è stato indicato per imitare la malattia-come i cambiamenti nel fegato, intestino e reni26,27,28,29.
Tuttavia, l’elaborazione del tessuto polmonare rimane impegnativo per diversi motivi. A differenza di tessuto solido, parenchima polmonare nativo tende a comprimere senza ventilazione ed esibisce inferiore rigidità dei tessuti. Queste proprietà ostacolano l’affettamento del tessuto. Così, riempimento delle vie aeree e lo spazio alveolare con basso punto di fusione dell’agarosi punto conserva la struttura del polmone nativo e fornisce la rigidità necessaria per taglio di precisione affettare di polmoni murine ed umane30. Resectates di polmone umano donato per scopi di ricerca sono per loro natura anatomicamente, geneticamente e fisiologicamente altamente diversificata, così spesso che presenta un’alta variabilità inter-paziente durante l’esecuzione di esperimenti25. In contrasto con l’intero lobo o espianti intero polmone, campioni del polmone resecati mediante chirurgia toracica non necessariamente seguire i segmenti anatomici e, pertanto, richiedono una preparazione speciale. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato e ottimizzato per la generazione di tributo umano dal tessuto polmonare resecato e loro successiva coltivazione e uso sperimentale all’affezione polmonare di modello.
Il protocollo descritto in questo manoscritto copre la generazione di tributo da resectates tessuto polmonare umano riempiendolo con liquido agarosio e successiva vibratome affettare. Generazione delle fette del tessuto è stata dimostrata prima per un paio di organi, come fegato e cervello, mentre la rigidità intrinseca di questi organi ammessi diretta affettare senza alcuna modifica del tessuto. Di nota, l’adeguata preparazione iniziale del tessuto polmonare è il passaggio più importante nella generazione di tributo. Riempimento dell’agarosi del polmone è il metodo di scelta per stabilizzare la sua natura morbida ed elastica e di garantire una produzione di tributo omogeneo e riproducibile. Grandi vie aeree del tessuto polmonare resecato sono cannulati per fornire accesso alle piccole vie aeree, nonché per il parenchima polmonare intatta. La mancanza di un pleura intatto, che rende quasi impossibile la agarosio riempimento, è delle principali ragioni perché tessuto polmonare per lo più non è utilizzabile per affettare del polmone. Prospetticamente, una pleura sintetico originariamente progettato per eseguire gli esperimenti funzionali su impalcature di decellularizzazione potenzialmente potrebbe essere applicato per ottenere successo dell’agarosi riempimento degli espianti che non dispongono di un intatto pleura31. Resezioni risultante in un pezzo di tessuto polmonare umano con intatto pleura sono essenziali per la generazione di blocchi di tessuto per affettare. Tessuto resecato è più disponibile a causa di tumore-liberi del tessuto da resezioni del cancro del rispetto completamente intatti lobi o espianti di intero-polmone di pazienti che hanno subito il trapianto del polmone.
Comunemente, i due sistemi vengono utilizzati per produrre tributo: il Krumdieck del tessuto affettatrice15 e vibranti microtomi (vibratomes). Affettatrici di tessuto generano fette facendo passare un blocco di tessuto attraverso un serbatoio metallico, che taglia il tributo a 90° alla fine di questa nave. Vibratomes generare tributo spostando un vibrante coltello orizzontalmente sopra un blocco ancorato del tessuto che è immerso in un bagno di medie raffreddato, che rispetto all’affettatrice Krumdieck esercita meno forza di taglio sul tessuto. Ciò provoca meno duro trattamento del tessuto prima di coltivazione. D’altra parte, il taglio del vibratome è più tempo e lavoro consumando. Nelle nostre mani, vibratome affettare abilitata alla produzione di un massimo di 100 tributo o 500 tributo pugni in un giorno, sufficiente per gli studi più sperimentali. TRIBUTO può essere coltivato in vari modi: (a) allegato ai Trans-pozzi, generando così un’interfaccia liquido aria sistema (ALI), (b) come cultura di organo dinamico (DOC), o (c) sommersa in mezzo di coltura cellulare alle condizioni di coltura cellulare standard. La coltivazione in dettaglio del tributo era precedentemente descritti22,23,25; Tuttavia, uno standard comune delle condizioni di coltivazione tra loro utilizzo in vari laboratori in tutto il mondo è ancora mancano. In particolare, il tempo di cultura potrebbe essere critico: come in murino tributo, una perdita di cellule alveolari di tipo positivo 2 SFTPC è osservata dopo 144 h, ma non dopo 120 ore22. Inoltre, attività metabolica sembra rimanere stabile in murino22 e tributo umano25 per 120 ore.
Ci sono un paio di limitazioni tecniche per la generazione di tributo: il numero e le dimensioni del resectates varia nel tempo; l’efficienza di agarosio di riempimento, che dipende dalla presenza della pleura intatta all’interno del tessuto ottenuto, determina il successo finale della generazione tributo; e distruzione del tessuto causata dalle mutazioni patologiche all’interno del tessuto polmonare (malato) ottenuti potrebbe interferire con la preparazione di tributo. Ostruzioni delle vie aeree e tessuto fibrotico manca spazio alveolare intatto ostacolare con agarosio riempimento e quindi rendere affettare del tessuto fibrotico un compito impegnativo. Enfisematose tessuti come trovano in malattie come BPCO o deficit di alfa-1-anti-tripsina non potrebbe sopportare la pressione di riempimento dell’agarosi e si tradurrà in rottura dei manufatti architettonici e gli alveoli. In questi casi, l’utilizzo di agarosio bassa concentrazione, ad esempio, 1% (p/v), potrebbe essere utile per diminuire la pressione e la velocità durante il riempimento dell’agarosi. Nel complesso, lo stato di malattia del tessuto può limitare drasticamente l’uso del tessuto per la generazione di tributo. Tutti questi parametri determinano l’importo del tributo che può essere generato dal tessuto polmonare, e anche la quantità di tempo che ci vuole per produrre il tributo. Ulteriori limitazioni di tributo sono incoerenze tra fette di polmone diversi rispetto al contenuto di dimensioni o del tessuto, che richiede ulteriori passaggi della normalizzazione per esperimenti. Per ovviare a questo, punzoni di biopsia delle regioni simili della stessa fetta possono essere generati. Questa procedura è in grado di ridurre la variabilità del tessuto e, come vantaggio aggiuntivo, aumentare il numero di campioni di tributo che può essere utilizzato per gli esperimenti.
In conclusione, colture del tessuto polmonare umano 3D da agarosio riempito tributo forniscono un modello umano complesso per lo studio della fisiologia polmonare e malattie. Il protocollo fornisce una descrizione dettagliata della preparazione del tributo da tessuto polmonare resecato e la loro coltivazione e inoltre affronta sfide in agarosio ripieno di resezioni polmonari umane e come superarli.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori sono grati a Marisa Neumann per assistenza tecnica. Tutti i tessuti del polmone sono state gentilmente concesse da CPC-M Bio-archivio. Questo lavoro è stato supportato dal centro tedesco di sovvenzioni del polmone ricerca (DZL), l’Associazione Helmholtz e CPC Research School.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |