نقدم هنا، على بروتوكول لإعداد شرائح مملوءة [اغروس] البشرية دقة قطع الرئة من أنسجة المريض مستأصل مناسبة لتوليد الثقافات أنسجة الرئة 3D لأمراض الرئة البشرية النموذجية في الدراسات البيولوجية والطبية الحيوية.
ترجمة اكتشافات جديدة للأمراض التي تصيب البشر محدود بتوافر النماذج المستندة إلى الأنسجة البشرية للمرض. الرئة دقة قطع شرائح (بكلس) يستخدم كثقافات أنسجة الرئة 3D (3D-الصلب) تمثل أنيقة ونموذج الثقافة الخلية 3D بيولوجيا وثيق الصلة، التي تشبه جداً الأنسجة في الموقع بسبب تعقيدها، الميكانيكا الحيوية والجزيئية تكوين. تشريح الأنسجة يتم تطبيقها على نطاق واسع في مختلف النماذج الحيوانية. يمكن استخدام 3D-الصلب المستمدة من بكلس البشرية لتحليل الردود على أدوية جديدة، مما قد يساعد أيضا فهم أفضل للآليات والآثار الفنية للمخدرات في الأنسجة البشرية. إعداد بكلس من عينات أنسجة الرئة مستأصل جراحيا المرضى، الذين عانوا من الرئة lobectomy، يزيد من إمكانية الوصول للمريضة والأنسجة بيريتومورال. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلاً لتوليد بكلس البشرية من أنسجة الرئة المريض لينة مطاطا مستأصل جراحيا. [اغروس] قدم في الفضاء للفيسيولوجيا من ريسيكتاتيس، ومن ثم الحفاظ على بنية الرئة وزيادة صلابة للأنسجة، هو أمر حاسم لتقطيع اللاحقة. 500 ميكرومتر سميكة شرائح أعدت من كتلة الأنسجة مع فيبرتوم. اللكمات خزعة مأخوذة من بكلس ضمان أحجام عينات الأنسجة قابلة للمقارنة وكذلك زيادة كمية عينات الأنسجة. ويمكن تطبيق ثقافات أنسجة الرئة الذي تم إنشاؤه في مجموعة متنوعة من الدراسات في علم الأحياء الرئة البشرية، بما في ذلك الفيزيولوجيا المرضية والآليات من أمراض مختلفة، مثل عمليات تليفية في المستويات الخلوية أفضل في (sub-). فائدة أعلى 3D–LTC السابقين فيفو نموذج هو تمثيلها الوثيق في الرئة البشرية في الموقع فيما يتعلق بهندسة الأنسجة 3D وتنوع نوع الخلية وتشريح الرئة، فضلا عن إمكانية تقييم للأنسجة من المرضى الفردية، التي هو ذات الصلة لمواصلة تطوير استراتيجيات جديدة للطب الدقة.
أمراض الرئة المزمنة والحادة سبب رئيسي للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم1. للمرضى الذين يعانون من أمراض الرئة المزمنة مثل مرض الانسداد الرئوي (COPD)2والربو الشديد3، وسرطان الرئة4 و أمراض الرئة متني منتشر5، العلاجات العلاجية حاليا غير متوفرة. على الرغم من أن الدراسات في النماذج الحيوانية لأمراض الرئة أدت إلى تعميق فهم المرض باثوميتشانيسمس6 وأدت إلى تحديد المحتملة الأهداف العلاجية رواية7،،من89، يحمل هذه النماذج ذات الصلة الاختلافات البيولوجية والفسيولوجية بالمقارنة مع10من البشر. للتغلب على هذه التناقضات بين البيولوجيا مورين والبشرية فضلا عن علم التشريح، البشرية السابقين فيفو زراعة أنسجة الرئة 3D تستخدم أنظمة (3D–LTC) في مختلف مجالات البحوث الطبية الحيوية. وتستند هذه النظم الثقافة 3D–LTC الرئة دقة قطع شرائح (بكلس). جيل بكلس السابقين فيفو يسمح تحليل أبعاد المكانية الثالث، الذي يسمح لتحقيق العلاقات المكانية والوظيفية للخلايا في كامل الحويصلات الهوائية والخطوط الجوية11، فضلا عن إينتيرستيتيوم، والمفرج و mesothelium. جدير بالذكر أن يتم بكلس السابقين فيفو نماذج متعددة الخلايا، مما يعني أنها تحتوي على خلايا وظيفية أكثر من الرئتين في الموقع وهكذا وثيقة تمثل البيئة البيولوجية الأصلية للخلايا وبالتالي التغلب على محدودية خلية خلية والخلية-مصفوفة التفاعل في 2D معظم خلية ثقافة النهج. وحتى الآن، السابقين فيفو مورين بكلس واستخدمت نموذج الأمراض الرئوية، ومثل هذا المرض12، تليف الرئة13، وسرطان الرئة14، والعدوى الفيروسية15،16، وخلل التنسج القصبي الرئوي17، و 18من الربو. غير أن نسبة كبيرة من العلاجات المخدرات الرواية في أمراض الرئة البشرية التي جرى التحقيق في التجارب السريرية لا تترجم إلى العيادة بسبب افتقارها إلى الفعالية أو السلامة، assumingly نظراً لبعد خلافات كبيرة بين الإنسان و مورين البيولوجيا والمرض19،،من2021.
على مدى السنوات العديدة الماضية، استخدمت بكلس البشرية إلى حد كبير لتقييم الرئة السمية للمواد الكيميائية والمخدرات. إلا في الآونة الأخيرة، وقد استخدم أنسجة الرئة البشرية من المرضى الذين يعانون من هذا المرض22،23،24من الربو، و تليف الرئة25، متابعة الدراسات الفيزيولوجية المرضية والدوائية. استخدام مادة مستأصل الجهاز المريض وتوليد بكلس منه، واحد يمكن أن الخص بصمات الأمراض الرئيسية أنسجة ثلاثية الأبعاد معقدة بيئة22 يمثلون وصيانة معظم التنوع الخلوية أصلية للجهاز. وعلاوة على ذلك، أبدى الأنسجة المريضة تطبيقها في مجموعة متنوعة من الأجهزة التجريبية لمحاكاة التغييرات مثل مرض في الكبد والأمعاء والكلى26،27،،من2829.
ومع ذلك، معالجة أنسجة الرئة لا تزال صعبة لعدة أسباب. خلافا للأنسجة الصلبة، يميل إلى الانهيار دون تهوية الرئة الأصلية حمة ومعارض أقل صلابة الأنسجة. هذه الخصائص تعوق تشريح الأنسجة. وهكذا، بملء الخطوط الجوية والفضاء السنخية مع [اغروس] نقطة انصهار منخفضة يحافظ على بنية الرئة الأصلية ويوفر صلابة اللازمة لدقة قطع تشريح الرئتين مورين والبشرية30. ريسيكتاتيس الرئة البشرية التي تبرعت بها لأغراض البحث بطبيعتها تشريحيا ووراثيا وفسيولوجيا عاليا المتنوعة، وبالتالي كثيرا ما عرض تقلب بين مريض عالية عند إجراء تجارب25. على النقيض من الفص كله أو explants الرئة كلها، عينات الرئة مستأصل عن طريق جراحة الصدر ليس بالضرورة اتبع الأجزاء التشريحية و، ولذلك تتطلب أعدادا خاصا. في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول مفصل والأمثل لتوليد بكلس البشرية من أنسجة الرئة مستأصل وزراعة اللاحقة والاستخدام التجريبي لأمراض الرئة النموذجية.
ويغطي البروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة جيل بكلس من ريسيكتاتيس أنسجة الرئة البشرية بتعبئته بسائل [اغروس] وتقطيع فيبرتوم اللاحقة. جيل شرائح الأنسجة تجلى قبل لاثنين من الأجهزة، مثل الكبد والدماغ، بينما يسمح تصلب الملازمة لهذه الأجهزة مباشرة تقطيع دون أي تعديل للأنسجة. من المذكرة، هو إعداد المناسبة الأولى لانسجة الرئة والخطوة الأكثر أهمية في توليد بكلس. [اغروس] ملء الرئة هو الأسلوب المفضل لتحقيق الاستقرار في طبيعته لينة ومرنة، وضمان جيل بكلس متجانسة واستنساخه. هي مقني الخطوط الجوية الكبيرة من أنسجة الرئة مستأصل لتوفير الوصول إلى الخطوط الجوية الصغيرة، فضلا عن حمة الرئة سليمة. عدم غشاء الجنب سليمة، مما يجعل من المستحيل تقريبا [اغروس] ملء، هو سبب رئيسي لماذا أنسجة الرئة ليس معظمها قابلة للاستخدام لتقطيع الرئة. مستقبلي، يمكن تطبيقها الجنب اصطناعية المصممة أصلاً لإجراء التجارب الفنية على السقالات ديسيلولاريزيد يحتمل أن تكون لتحقيق نجاح [اغروس] بملء explants التي تفتقر الجنب سليمة31. ريسيكشنز أدى إلى قطعة أنسجة الرئة بشرية مع الجنب سليمة ضرورية لتوليد كتل الأنسجة للتقطيع. نسيج مستأصل يتوفر أكثر بسبب خالية من ورم الأنسجة من سرطان ريسيكشنز من الفصوص سليمة تماما أو explants الرئة كل من المرضى الذين خضعوا زرع الرئة.
عادة، تستخدم نظامين لإنتاج بكلس: كرومديك الأنسجة مقسم طريقة العرض15 والاهتزاز ميكروتوميس (فيبراتوميس). توليد الأنسجة تقطيع شرائح بتمرير كتلة أنسجة من خلال سفينة معدنية، والتخفيضات بكلس على 90 درجة في نهاية هذه السفينة. إنشاء فيبراتوميس بكلس عن طريق تحريك تهتز سكين أفقياً عبر كتلة رأسية للأنسجة التي هي غارقة في حمام متوسط المبردة، مقارنة بتقطيع كرومديك يمارس أقل قوة القص في الأنسجة. ينتج عن هذا أقل معاملة قاسية من قبل زراعة الأنسجة. من ناحية أخرى، يتم قطع فيبرتوم المزيد من الوقت والعمل المستهلكة. في أيدينا، اللكمات فيبرتوم تشريح مكن إنتاج 100 بكلس أو بكلس 500 كحد أقصى في اليوم الواحد، يكفي للدراسات التجريبية الأكثر. يمكن أن يكون مثقف بكلس بطرق مختلفة: (أ) تعلق على ترانس-الآبار، وبالتالي توليد هواء سائل واجهة النظام (على)، (ب) كهيئة دينامية الثقافة (DOC)، أو (ج) غارقة في خلية ثقافة المتوسطة في ظروف ثقافة الخلية القياسية. زراعة بكلس في التفصيل تم وصفه سابقا22،،من2325؛ ومع ذلك، معيار مشترك لظروف زراعة بين استخداماتها في مختبرات مختلفة حول العالم مازال مفقوداً. على وجه الخصوص، قد يكون الوقت الثقافة الحيوية: كما هو الحال في بكلس مورين، لوحظ فقدان خلايا نوع السنخية الإيجابية 2 سفتبك بعد ح 144، ولكن ليس بعد 120 ح22. وباﻹضافة إلى ذلك، يبدو النشاط الأيضي تبقى مستقرة في مورين22 والبشرية بكلس25 لح 120.
وهناك زوجين من القيود التقنية لتوليد بكلس: عدد وحجم ريسيكتاتيس يتقلب على مر الزمن؛ كفاءة [اغروس] ملء، الذي يعتمد على وجود غشاء الجنب سليمة داخل الأنسجة التي تم الحصول عليها، ويحدد النجاح النهائي لتوليد بكلس؛ وتدمير الأنسجة الناجمة عن التغيرات المرضية في أنسجة الرئة (المريضة) التي تم الحصول عليها قد تتداخل مع إعداد بكلس. عوائق مجرى الهواء وأنسجة تليفية تفتقر إلى الفضاء السنخية سليمة تعوق مع [اغروس] شغل وبالتالي جعل تشريح أنسجة تليفية مهمة شاقة. الأنسجة امفيسيماتوس كما وجدت في أمراض مثل هذا المرض أو عوز ألفا-1-مكافحة-التربسين قد لا تصمد أمام الضغط [اغروس] شغل، وسيؤدي إلى تمزق الحويصلات الهوائية والتحف المعمارية. وفي هذه الحالات، قد يكون من المفيد تقليل الضغط والسرعة أثناء الملء [اغروس] استخدام تركيزات منخفضة [اغروس]، مثل، 1% (w/v)،. إجمالاً، حالة المرض الأنسجة يمكن كبير الحد من استخدام الأنسجة لجيل بكلس. كل هذه المعايير بتحديد قيمة بكلس التي يمكن أن تتولد من أنسجة الرئة وأيضا مقدار الوقت المستغرق في إنتاج بكلس. زيادة القيود المفروضة على بكلس هي التناقضات بين شرائح مختلفة من الرئة فيما يتعلق بحجم أو الأنسجة المحتوى، الأمر الذي يتطلب المزيد من خطوات التطبيع للتجارب. للتغلب على هذا، يمكن أن تتولد اللكمات خزعة من مناطق مماثلة من نفس الشريحة. هذا الإجراء ملائمة للحد من تقلب الأنسجة، وكما ميزة إضافية، زيادة عدد العينات بكلس التي يمكن استخدامها لإجراء التجارب.
وفي الختام، شغل زرع الأنسجة البشرية الرئة 3D من [اغروس] بكلس تقديم نموذج بشرية معقدة لدراسة فسيولوجيا الرئة وأمراض. البروتوكول يوفر وصفاً مفصلاً لإعداد بكلس من أنسجة الرئة مستأصل وزراعتها، وعلاوة على ذلك ويتناول التحديات في ملء [اغروس] ريسيكشنز الرئة البشرية وكيفية التغلب عليها.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب ممتنون لنيومان ماريسا لخبراء المساعدة التقنية. وكانت جميع أنسجة الرئة يرجى المقدمة من الحزب الشيوعي الصيني-م بيو-الأرشيف. وأيد هذا العمل المركز الألماني للمنح البحثية الرئة (دزل)، ورابطة هلمهولتز ومدرسة الحزب الشيوعي الصيني للبحث.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |