Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo
Summary
Aqui, descrevemos 3 modelos de lesão de zebrafish adultos e seu uso combinado com tratamento de drogas imunossupressoras. Nós fornecemos orientação nas imagens de regenerar tecidos e na detecção de mineralização óssea nele.
Abstract
Zebrafish são capazes de regenerar vários órgãos, incluindo os apêndices (aletas) após amputação. Isso envolve a regeneração do osso, que regrows dentro de aproximadamente duas semanas após a lesão. Além disso, zebrafish são capazes de curar ossos rapidamente após a trepanação do crânio e reparar fraturas que podem ser facilmente introduzidas em raios de barbatana ósseas zebrafish. Estes ensaios de lesões representam paradigmas experimentais viáveis para testar o efeito de drogas administradas em rapidamente formando o osso. Aqui, descrevemos o uso destes modelos 3 lesões e seu uso combinado com tratamento glicocorticoide sistêmico, que exerce efeitos inibitórios e imunossupressoras de osso. Nós fornecemos um fluxo de trabalho sobre como se preparar para tratamento imunossupressor no zebrafish adulto, ilustram como realizar amputação de barbatanas, trepanação de raspagem ossos e fraturas de barbatana e descrever como o uso de glicocorticoides afeta ambos osso formando osteoblastos e células da linhagem de monócitos/macrófagos como parte da imunidade inata no tecido ósseo.
Introduction
Zebrafish representam um poderoso modelo animal para estudar a doença e desenvolvimento de vertebrados. Isto é devido ao fato de que eles são pequenos animais que se reproduzem muito bem e que o seu genoma é totalmente sequenciado e passível de manipulação1. Outras vantagens incluem a opção de executar a imagem ao vivo contínua em diferentes fases, incluindo no vivo por imagens do zebrafish adulto2e a capacidade de executar telas de drogas de alto throughput em zebrafish larvas3. Além disso, o zebrafish possuem uma alta capacidade regenerativa em uma variedade de órgãos e tecidos, incluindo o osso e, portanto, servir como um sistema útil para estudar a doença do esqueleto e reparar4,5.
Osteoporose induzida por glicocorticoide (GIO) é uma doença que resulta do tratamento a longo prazo com glicocorticoides, por exemplo, no curso de tratamento de doenças auto-imunes, tais como de asma ou artrite reumatoide. GIO desenvolve-se em cerca de 30% dos pacientes tratados com glicocorticoides e representa uma grande saúde questão6; Portanto, é importante investigar o impacto da imunossupressão no tecido ósseo em grande detalhe. Nos últimos anos desenvolveram-se uma variedade de modelos de zebrafish, lidando com a patogênese da GIO. Perda óssea mediada por glicocorticoide tem sido induzida no zebrafish as larvas, por exemplo, que levou à identificação de compostos antídoto, aumentando a massa óssea em uma droga tela7. Além disso, efeitos inibitórios óssea induzida por glicocorticoides têm sido imitados no zebrafish escalas tanto in vitro e in vivode8,9. Estes ensaios são muito convincentes abordagens, especialmente quando se trata de identificação de novos medicamentos imunossupressores e osso de anabólico. No entanto, eles apenas parcialmente levam em conta o endoesqueleto e não tem sido realizados num contexto regenerativo. Assim, eles não permitem a investigação dos efeitos mediados por glicocorticoide durante rápidas modos de formação do osso adulto, regenerativa.
Aqui, apresentamos um protocolo que permite aos pesquisadores estudar os efeitos mediada por glicocorticoide em ossos de zebrafish adultos submetidos a regeneração. Modelos de lesão incluem amputação parcial de zebrafish barbatana caudal, trepanação do crânio, bem como a criação de fraturas de raio de barbatana (figura 1A-1-C) e são combinados com glicocorticoides exposição através de incubação (Figura 1E ). Recentemente usamos uma parte do presente protocolo para descrever as consequências da exposição a prednisolona, um dos medicamentos comumente prescritos corticosteroides, em adultos do zebrafish regenerando fin e crânio osso10. No zebrafish, administração de prednisolona leva à proliferação osteoblástica diminuída, diferenciação osteoblástica incompleta e rápida indução da apoptose na linhagem monócitos/macrófagos10. Neste protocolo, também descrevemos como fraturas podem ser introduzidas na única barbatana ósseas ray segmentos11, como esta abordagem pode ser útil quando estudando efeitos mediados por glicocorticoide no osso ocorrendo durante o reparo de fratura. Os métodos apresentados aqui ajudarão a mais endereço subjacente mecanismos de ação do glicocorticoide em rápida regeneração óssea e também podem ser empregados em outras configurações de administração de drogas sistêmicas no contexto da regeneração de tecidos do zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish provaram ser úteis em pesquisa esquelética em muitos aspectos. Selecionado mutantes imitam aspectos das doenças humanas, tais como osteogênese imperfeita ou osteoartrite23,24,25,26,27, e as larvas, bem como escalas estão sendo usadas para Identifica compostos anabólicos de osso na molécula pequenas telas7,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado por uma concessão do centro de regenerativa terapias Dresden (“Zebrafish como um modelo para desvendar os mecanismos da perda óssea induzida por glicocorticoide”) e, adicionalmente, por uma concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, projeto 387653785) para FK. Estamos muito gratos a Jan Kaslin e Avinash Chekuru por sua orientação e assistência na realização de trepanação do Calvárias e fraturas nos raios da barbatana ósseas. Experimentos foram projetados, executados e analisados por KG e FK. FK escreveu o manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Katrin Lambert, Nicole Cudak e outros membros dos laboratórios Knopf e marca para assistência técnica e discussão. Nossos agradecimentos também vai Marika Fischer e Jitka Michling para cuidados excelentes peixes e Henriette Knopf e Josh Currie para revisão do manuscrito.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
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