성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구
Summary
여기, 우리 3 성인 zebrafish 부상 모델 및 면역 억제 약물 치료와 결합 된 그들의 사용을 설명합니다. 우리는 거기에 뼈 강화 작용을 감지 및 조직 재생의 이미징에 지침을 제공 합니다.
Abstract
Zebrafish 절단 후 부속 (핀)를 포함 하 여 다양 한 장기를 다시 생성할 수 있습니다. 이 부상 후 약 2 주 이내 regrows 뼈의 재생을 포함 한다. 또한, zebrafish trepanation는 두개골의 후 뼈를 빠르게 치유 하 고 복구 zebrafish 뼈 탄 미 익 광선에 쉽게 도입 될 수 있는 골절 수 있습니다. 이러한 상해 분석 빠르게 뼈 형성에 관리 약물의 효과 테스트 가능한 실험 패러다임을 나타냅니다. 여기, 우리는 이러한 3 부상 모델의 사용과 뼈 억제 하 고 면역 억제 효과 미치는 조직의 glucocorticoid 치료와 함께 그들의 결합된 사용 설명. 우리 성인 zebrafish에 면역 억제 치료에 대 한 준비, 지 느 러 미 절단, calvarial 뼈와 지 느 러 미 골절의 trepanation 수행 하는 방법을 설명 하 고 스테로이드 제제의 사용에 미치는 두 뼈 형성을 설명 하는 방법에 대 한 워크플로우를 제공 osteoblasts 그리고 뼈 조직에 있는 타고 난 면제의 일부로 monocyte/대 식 세포 계보의 세포.
Introduction
Zebrafish는 척추 개발 및 질병 연구에 강력한 동물 모델을 나타냅니다. 그들은 매우 잘 번 식 하는 작은 동물 및 그들의 게놈은 완전히 시퀀스이 고 조작1의무가 있다는 사실 때문입니다. 다른 장점은 지속적인된 라이브 이미징 vivo에서 화상 진 찰 성인 zebrafish2, 및 높은 처리량 약 스크린 zebrafish 애벌레3에서 수행할 수 있는 능력을 포함 한 여러 단계에서 수행 하는 옵션을 포함 합니다. 또한, zebrafish 장기와 조직, 뼈 등의 다양 한에서 높은 재생 능력을 보유 하 고 따라서 골격 질환을 연구 하 고 수리4,5유용한 시스템 역할.
Glucocorticoid 골다공증 (GIO) 예 천식이 나 류 마티스 관절염과 같은 자가 면역 질환 치료 과정에서 스테로이드 제제와 장기 치료에서 결과 질병 이다. GIO는 glucocorticoid 치료 환자의 약 30%에서 개발 하 고 주요 건강 문제6;를 나타냅니다. 따라서, 그것은 훌륭한 세부 사항에서 뼈 조직에 면역 억제에 미치는 영향을 조사 하는 것이 중요입니다. 최근 몇 년 동안에서 다양 한 GIO의 병 인을 다루는 zebrafish 모델 개발 되었습니다. Glucocorticoid 중재 뼈 손실 zebrafish 애벌레, 예를 들어 마약 화면7뼈 질량을 증가 하는 counteractive 화합물의 식별에 지도에서 유발 되었습니다. 또한, 뼈 glucocorticoid 유발 억제 효과에 유사 되었습니다가지고 zebrafish 비늘 생체 외에서 그리고 vivo에서8,9. 이 분석 실험은 매우 설득력 있는 접근, 그것에 관해서 특히 소설 면역과 뼈 근육 약물의 식별. 그러나, 그들은 부분적으로 endoskeleton 고려 하 고 재생 컨텍스트에서 수행 되지. 따라서, 그들은 성인, 재생 뼈 형성의 빠른 모드 동안 glucocorticoid 중재 효과의 조사를 허용 하지 않습니다.
여기, 선물이 성인 zebrafish 뼈 재생을 겪고 glucocorticoid 중재 효과 공부 하는 연구자를 사용 하는 프로토콜. 부상 모델은 zebrafish 꼬리 지 느 러 미, 지 느 러 미 레이 골절 (그림 1A-1 C)의 창조 뿐만 아니라, 두개골의 trepanation의 부분 절단을 포함 하 고 glucocorticoid 노출을 통해 인큐베이션 (그림 1E와 결합 ). 최근 성인 zebrafish 지 느 러 미와 두개골 뼈10회생에 prednisolone, 일반적으로 된 코르 티 코 스테로이드 약물 중 하나에 노출의 결과 설명 하기 위해이 프로토콜의 일부를 사용 했습니다. Zebrafish에 prednisolone 관리 감소 osteoblast 확산, 불완전 osteoblast 차별화 및 monocyte/대 식 세포 계보10apoptosis의 급속 한 유도 이끌어 낸다. 이 프로토콜에서 우리 또한 설명 어떻게 골절 한 뼈 핀 레이 세그먼트11, 도입 하실 수 있습니다이 방법은 골절 복구 중 발생 하는 뼈에 glucocorticoid 중재 효과 공부를 할 때 유용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법을 빠르게 뼈 재생에 glucocorticoid 행동의 메커니즘을 기본 추가 주소에 도움이 될 것입니다 그리고 zebrafish 조직 재생의 맥락에서 체계적 약국의 다른 설정에도 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish는 많은 관계에서 골격 연구에 유용한 입증 했다. 선택 된 돌연변이 모방 골 imperfecta 등 관절염23,,2425,26,27, 인간 질병의 측면 그리고 애벌레 뿐만 아니라 저울에 사용 되 고 있습니다. 작은 분자 스크린7,,28<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 센터의 재생 치료 드레스덴의 (“Zebrafish 모델 glucocorticoid 유발 뼈 손실의 메커니즘을 해명 하기”) 교부 금에 의해 그리고 또한 도이치 가운데 (Transregio 67, 프로젝트의 교부 금에 의해 지원 되었다 387653785) FK를. 우리는 그들의 지도 원조 뼈 다 귀 탄 미 익 광선에 calvariae 및 골절의 trepanation 수행에 대 한 1 월 Kaslin를 Avinash Chekuru 매우 감사. 실험 설계, 수행 되었고 KG와 FK에 의해 분석. FK 원고를 썼다. 우리 또한 카트린 램버트, 니콜 Cudak와 기술 지원 및 토론을 위한 Knopf와 브랜드 연구소의 다른 회원 들에 게 감사 하 고 싶습니다. 우리의 감사는 또한 Henriette Knopf와 원고를 교정에 대 한 조 쉬 커리 마리카 피셔와 훌륭한 물고기에 대 한 Jitka Michling을 갑니다.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
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