Erwachsenen Zebrafisch Verletzungen Modelle zur Untersuchung der Auswirkungen von Prednisolon bei der Regeneration von Knochengewebe
Summary
Hier beschreiben wir 3 Erwachsene Zebrafisch-Verletzung-Modelle und ihre kombinierte Nutzung mit immunsuppressiven medikamentösen Behandlung. Wir betreuen über Bildgebung Gewebe zu regenerieren und Mineralisierung der Knochen darin erkennen.
Abstract
Zebrafisch sind in der Lage, verschiedene Organe, einschließlich Anhängsel (Flossen) nach Amputation zu regenerieren. Dazu gehört die Regeneration von Knochen, die innerhalb von etwa zwei Wochen nach der Verletzung nachwächst. Darüber hinaus Zebrafisch sind in der Lage zu heilen Knochen schnell nach Trepanation des Schädels, und reparieren Sie Brüche, die in Zebrafisch knöchernen Fin Strahlen leicht eingeführt werden können. Diese Verletzungen Assays repräsentieren machbare experimentelle Paradigmen, die Wirkung der verabreichten Medikamente auf die Bildung von Knochen schnell zu testen. Hier beschreiben wir die Verwendung dieser 3 Verletzungen-Modelle und ihre kombinierte Nutzung mit systemischer Glukokortikoid-Behandlung, die Knochen hemmenden und immunsuppressive Effekte ausübt. Wir geben einen Workflow zur immunsuppressiven Behandlung bei Erwachsenen Zebrafisch vorzubereiten, veranschaulichen, wie Fin Amputation, Trepanation von calvarial Knochen und Fin Frakturen, durchführen und beschreiben, wie der Einsatz von Glukokortikoiden beeinflusst beide Knochen bilden Osteoblasten und Zellen der Monocyte/Makrophagen-Linie als Teil der angeborenen Immunität im Knochengewebe.
Introduction
Zebrafisch stellen eine leistungsfähige Tiermodell vertebrate Entwicklung und Krankheit zu studieren. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass sie sind kleine Tiere, die sehr gut zu züchten und dass ihr Genom vollständig sequenziert und Manipulation1zugänglich ist. Weitere Vorteile sind die Möglichkeit, weiterhin live Bildgebung in den verschiedenen Phasen, einschließlich der in-Vivo Bildgebung von Erwachsenen Zebrafisch2und die Fähigkeit zur Hochdurchsatz-Drogen-Bildschirme im Zebrafisch-Larven-3durchführen. Darüber hinaus Zebrafisch besitzen eine hohe Regenerationsfähigkeit in einer Vielzahl von Organen und Geweben, einschließlich Knochen und dienen damit als ein nützliches System Skelett Krankheit zu untersuchen und reparieren4,5.
Glukokortikoid-induzierte Osteoporose (GIO) ist eine Erkrankung, die aus langfristigen Behandlung mit Glukokortikoiden, zum Beispiel im Zuge der Behandlung von Asthma oder rheumatoider Arthritis Autoimmun-Krankheit resultiert. GIO in etwa 30 % der Glukokortikoid-behandelten Patienten entwickelt und stellt ein großes gesundheitliches Problem6; Daher ist es wichtig, den Einfluss der Immunsuppression auf Knochengewebe im Detail zu untersuchen. In den letzten Jahren wurden eine Vielzahl von Zebrafisch-Modelle, die der Umgang mit der Pathogenese der GIO entwickelt. Glukokortikoid-vermittelten Knochenabbau wurde im zebrafischlarven, z. B. induziert die zur Identifizierung der entgegenwirkenden Verbindungen, die Erhöhung der Knochenmasse bei einer Droge Bildschirm7geführt. Darüber hinaus haben Glukokortikoid-induzierte Knochen hemmende Effekte nachgeahmt worden Zebrafisch skaliert in Vitro und in Vivo8,9. Diese Tests sind sehr überzeugende Ansätze, vor allem wenn es darum geht, die Identifizierung von neuartigen immunsuppressive und Knochen Anabolika. Jedoch nur zum Teil berücksichtigt das Endoskelett und haben in einem regenerativen Kontext nicht vorgetragen. So lassen sie nicht die Untersuchung der Glukokortikoid-vermittelten Effekte während der schnellen Modi der Erwachsenen, regenerative Knochenbildung.
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll Forscher um Glukokortikoid-vermittelten Effekte auf Erwachsene Zebrafisch Knochen in der Regeneration zu studieren. Verletzungen-Modelle beinhalten teilweise Amputation der Zebrafisch Schwanzflosse, Trepanation des Schädels sowie die Schaffung von Fin Ray Frakturen (Abbildung 1A-1 C) und werden kombiniert mit Glukokortikoid Exposition über Inkubation (Abbildung 1E ). Wir haben vor kurzem einen Teil dieses Protokolls verwendet, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber Prednisolon, eine der am häufigsten verschriebenen Kortikosteroide Drogen auf Erwachsene Zebrafisch regenerierende Fin und Schädel Knochen10beschreiben. Im Zebrafisch führt Prednisolon Verwaltung zu verminderter Osteoblasten Proliferation, unvollständige Osteoblasten Differenzierung und schnelle Induktion der Apoptose in der Monocyte/Makrophagen Linie10. In diesem Protokoll beschreiben wir auch wie Frakturen in einzelnen knöchernen Fin Ray Segmente11, eingebracht werden können wie dieser Ansatz nützlich sein kann, wenn Glukokortikoid-vermittelten Effekte auf Knochen auftritt während der Fraktur Reparatur zu studieren. Die hier vorgestellten Methoden werden dazu beitragen, weitere Adresse, die zugrunde liegenden Wirkmechanismen Glukokortikoid bei der Regeneration von Knochen schnell und können auch in anderen Situationen der systemischen Arzneimitteln im Rahmen der Zebrafisch Geweberegeneration eingesetzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisch haben sich bewährt im Skelett Forschung in vielerlei Hinsicht. Ausgewählten Mutanten imitieren Aspekte menschlicher Erkrankungen wie Osteogenesis Imperfecta oder Arthrose23,24,25,26,27, und Larven sowie Skalen werden verwendet, um Identifizieren Sie Knochen anabole Verbindungen in kleinen Molekül Bildschirme7,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von Zentrum für Regenerative Therapien Dresden (“Zebrafisch als Vorbild, die Mechanismen der Glukokortikoid-induzierten Knochenabbau zu entwirren”) und zusätzlich durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, Projekt 387653785) FK. Wir sind sehr dankbar, Jan Kaslin und Avinash Chekuru für ihre Beratung und Unterstützung zur Durchführung Trepanation von Calvariae und Frakturen in knöchernen Fin Strahlen. Experimente wurden so konzipiert, durchgeführt und analysiert durch KG und FK. FK schrieb das Manuskript. Wir möchten auch danke Katrin Lambert, Nicole Cudak und anderen Mitgliedern von den Knopf und Marke Labs für technische Hilfe und Diskussion. Unser Dank gilt auch Marika Fischer und Jitka Michling für ausgezeichneten Fisch Pflege und Henriette Knopf und Josh Currie für das Korrekturlesen der Handschrift.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
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