Summary

음이온 교환기 (Diethylaminoethyl-셀 루 로스 열)에 의해 혈액에서 아프리카를 포함 한 세포 외 Trypanosomes의 정화

Published: April 06, 2019
doi:

Summary

혈액에서 trypanosome 분리의이 방법은 포유류 혈액 세포 보다 덜 부정 되 고 그들의 표면 충전에 따라 다릅니다. 감염 된 혈액은 놓이고 음이온 교환기 열에 치료. 이 방법, 아프리카 trypanosomiasis에 대 한 가장 피팅 진단 면역학, 생물학, 생화학, 제약 및 분자 생물학 수사에 대 한 정화 기생충을 제공합니다.

Abstract

이 메서드는 trypanosomes, 기생충 감염 된 혈액에서 인간과 동물 아프리카 trypanosomiasis (모자)에 대 한 책임의 분리 수 있습니다. 첫 번째 무대 모자의 진단 위한 가장 좋은 방법 이며 또한이 기생충 정화 방법 serological 허가 하 고 조사 연구.

모자는 체체파리 비행 전송 Trypanosoma brucei gambiense 에 의해 발생 및 T. b. rhodesiense. 관련된 trypanosomes는 동물 trypanosomiasis의 원인이 되는 에이전트. Trypanosome 탐지 모자 진단, 치료 및 후속 필수적 이다. 여기에 설명 된 기술은 가장 중요 한 기생충 검출 기법, T. b. gambiense 모자의 진단에 대 한 필드 조건에 적응 이며, 1 시간 이내 완료 될 수 있다. 혈액은 pH 8, 이전 조정 하는 음이온 교환기 열 (DEAE 셀 룰 로스)에 층이 고 차입 버퍼 추가 됩니다. 덜 부정 청구 trypanosomes 통과 하는 반면 매우 부정적으로 위탁 된 혈액 세포는 열에 흡착 됩니다. 수집 된 trypanosomes 원심 분리에 의해 수송과 있으며 현미경으로 관찰. 또한, 기생충은 그들의 infectivity 유지 하는 동안 세포 손상 없이 준비 됩니다.

순화 trypanosomes는 필요한 면역 테스트; 그들은 trypanolysis 분석 결과, 모자 혈 청 학에 골드 표준에에서 사용 됩니다. 얼룩진된 기생충 필드 혈 청 학에 대 한 카드 교착 시험 (CATT)에 활용 됩니다. 항 원은 변형 표면 당단백질, exoantigens, 같은 순화 trypanosomes에서 다양 한 immunoassays에도 사용 됩니다. 여기에 설명 된 절차는 아프리카 trypanosomes;에 대 한 설계 되었습니다. 따라서, 크로마토그래피 조건 호스트 포유동물의 각 종족의 피를 각 trypanosome 스트레인, 그리고 더 일반적으로 적용할 수 있다.

병원 체를 매혹적인 이들은 쉽게 순화 하 고 사용 수 생화학, 분자 세포 생물학 연구 호스트 세포 막 수용 체, 신호 전달, 유전자의 수준에서 호스트 기생충 관계 조사와 공동 문화를 포함 하 여 식; 약물 테스트 시험관; 유전자 삭제, 돌연변이, 또는 신진 대사 과정, cytoskeletal 속 기생충 생존에 overexpression의 조사.

Introduction

제시 하는 방법을 설명 여기 trypanosomes, 기생충 혈액에서 인간과 동물 아프리카 trypanosomiasis (모자)에 대 한 책임의 분리를 수 있습니다. 이 첫 번째 무대 모자의 진단 위한 가장 좋은 방법 이며이 기생충 정화 방법 강력한 serological 및 연구 조사를 허용 하는 또한.

모자는 체체파리 비행 전송 Trypanosoma brucei gambiense T. b. rhodesiense1. 발생 이 protozoan 기생충 질병 (hemolymphatic 단계)의 첫 번째 단계에서 혈 류, 림프, 및 간 질 성 체액 extracellularly 곱하면 됩니다. 2 단계 (meningoencephalitic stage) 시작 때 기생충 혈액 뇌 장벽; 신경 징후,이 질병에 그것의 이름을 “잠자는 병” 주신, 수 면 장애를 포함 하 여이 2 단계2의 전형입니다. 관련된 trypanosomes (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei)는 동물 아프리카 trypanosomosis (AAT)3의 원인이 되는 에이전트.

세계 보건 기구 (WHO) 2020 공중 보건 문제로 모자를 제거 하 고 20304전송 중지를 목표로 합니다. 급속 한 진단 테스트의 최근 소개는 향상 된 혈 청 학적인 진단1,,45. 여러 가지 분자 진단 테스트 개발 되었습니다 하지만 필드 진단에 그들의 역할은 아직 되지 설립된5. 그들은 brucei 그룹 및 기생충 동물 trypanosomosis6에 대 한 책임에 의해 발생 하는 비정형 trypanosomiasis의 하위 종류를 식별 하는 데 사용 됩니다.

혈 청 학 틀린 긍정적이 고 불행 하 게도 틀린 부정적인 결과1을 줄 수 있는 기생충의 검출 진단, 치료 및 후속, 필수적 이다. 이러한 hemoflagellate 원생의 직접적인 현미경 관찰 모자 경우 발생 하는 T. b. gambiense, (케이스의 95% 이상)에 의해 낮은 parasitemias는 규칙으로 모자에 대 한 T. b. rhodesiense, 큰에 의해 발생 하는 반면에 어렵습니다. 기생충의 수는 자주 혈액에 존재 한다. 다양 한 농도 기술은 사용 된 두꺼운 드롭 등 세관 원심 분리 (CTC), 하지만 음이온 교환기 (DEAE 셀 룰 로스)의 열에 의해 혈액에서 기생충의 분리 다음 원심 분리와 현미경 관찰은 작은, 가장 민감한 방법 (혈액의 약 50 기생충/mL를 검출 될 수 있다)1,7. 따라서,이 음이온 교환기 (DEAE 셀 룰 로스) 메서드에서 trypanosomes의 정화는 최고 고, 데이트, 시각화 및 격리 모자 진단 위한 혈액에서 기생충에 대 한 참조 방법. 필드 조건에서 DEAE 룰의 미니 열 성공적으로 사용 되 고 현미경 관찰7,8을 촉진 하는 몇 가지 개선.

혈액, 아래 설명에서 trypanosome 분리의 방법은 포유류 혈액 세포9보다 덜 부정적 이다 기생충 표면 충전에 따라 다릅니다. 흥미롭게도,이 방법은 50 년 전, 박사 쉴라 란 햄에 의해 1968 년에 개발 되었다 고 검색 및 혈 류 trypanosomes의 준비에 대 한 황금 표준 남아. 그것은 빠르고 다양 한 포유류, 허용 하는 둘 다 인간과 동물 trypanosomiasis10의 진단에서에서 salivarian trypanosomes에 대 한 재현.

생활, 정화 기생충, 감염 된 혈액은 음이온 교환기 열에 추가 됩니다. 크로마토그래피 조건 (주로 pH, 이온 강도 버퍼/미디어의) 포유류 혈액 세포와 trypanosomes10각 믹스를 각 trypanosome 종, 그리고 더 일반적으로 적용할 수 있다. 차입 버퍼 pH 8 대부분의 아프리카 trypanosomes10정확 하 게 조정 됩니다. Parasitemias 너무 낮은 혼자, 현미경 관찰에 의해 검출 될 수 있기 때문에이 방법은 환자의 혈액에서 발견 하는 기생충의 농도 호의 하 고 실험실 조사 수 있습니다. 일 갓 격리 된 trypanosomes와이 기술을 사용 하 여 감염 된 동물의 혈액에 무기한 기간에 대 한 실험실에 있는 axenic 조건에서 배양 된 기생충으로 연구 보다는 다양 한 조사에 대 한 관련입니다.

호스트 기생충 관계는 기생충 감염, 따라서, 그것의 자연적인 호스트 T. musculi, 자연 murine 기생충, 세포 외 trypanosomes의 대표, murine 감염에 관련 된 많은 이점이 가장 공부를 작은 실험실 동물 생물 안전 수준 (BSL) 조건 필요 하지 않습니다. T. musculi 인간 병원 체를 포함 하 여 다른 많은 Trypanosoma 종 달리 immunocompetent 쥐 죽 일 하지 않습니다. T. musculi 는 T 세포를 박탈 쥐에서 제거 되지 하 고 parasitemias 식품 및 영양소 섭취 량11를 수정 하 여 감염 된 생쥐에서 증가할 수 있다. 이 기생충에는 다른 병원 체12co 감염에 면역 반응 조절 한다. T. musculi 교양된 T. musculi 에서 감염 된 쥐 전시 차이에서 예를 들어 막 Fc 수용 체의 식 T. musculi axenic 문화, 기생충 감염된 쥐13 에서 정화에 비해 손실 됩니다. , 14. Excreted 분 비 요소 (ESF) 또한 질적 및 양적 덜 axenic trypanosome 문화 표현 되며 발병 지역15에 고립 된 긴장 사이 다. ESF는 호스트 면역 시스템에 표시 되 고 그래서 플레이 초기 호스트에서 중요 한 역할 면역 응답16를 첫 번째 항.

실험적 감염 동물 실험실 조사,이 프로토콜 마우스 immunosuppressed 동물을 사용할 때에 특히 필요한 수를 최소화 하는 기생충의 더 많은 수에 용이. 변형 표면 glycoproteins (VSGs)에 사용 되는 카드 교착 테스트 Trypanosomiasis (CATT)에 대 한 대량 검사에는 여전히 쥐에서 전파 되는 trypanosomes에서 순화 된다. 2 급속 한 진단 테스트 (개별적으로 감싸인된 카세트)는 필드에서 사용 하기 위해 사용할 수 있는 네이티브 VSGs와 trypanosomes에 체 외에서 배양 하지1,4, 의 감염 모델 소스를 사용 하 아직도 5. 이후 자연스럽 게 또는 실험적으로 감염 된 호스트에서 대량 및 특히, 설치류 DEAE 룰 정화 기생충이 쉽게 얻을 수 있습니다 trypanosome 면역학 및 생물학의 연구에서 발전 촉진 되었습니다 있다.

Protocol

조사 관리 및 실험 동물 사용 (NIH 간행물 번호 85±23, 개정 1996)에 대 한 지침을 준수. 프로토콜은 우리의 지역 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 1입니다. 동물 8 10 주 오래 된, 20-25 g, 주택 시설 15 일전 각 실험 동물에서 세 여성 스위스 (의 1) 마우스를 유지. 보호, 온도 (22 ℃)와 습도 (50%)에 보관 통풍이 상자에 그들을 집합니다 룸, 12 시간 라이트 사이클 온/오프 제?…

Representative Results

순화 trypanosomes 제약 테스트에 사용 되었습니다. 기생충은 포함 하는 특정 약물, 혼자 또는 혼합19의 직렬 희석 문화 우물으로 전송 됩니다. 현미경 관찰, 운동 성 평가 생존의 표식만 몇 dugs 테스트 중인 때 수행할 수 있습니다, 그리고 반면 AlamarBlue 세포 생존 능력 분석 결과 약20를 심사 하는 동안 큰 운동 성 분석에 대 한 훌륭한 방법입?…

Discussion

순화 trypanosomes 면역학, 생화학, 세포 및 분자 생물학을 공부 하는 강력한 수단을 나타냅니다. 데이터 및 결과의 큰 확대는 다음 도움이 되는 정보를 얻기 위해 다른 진 핵 세포30trypanosomes에서 얻은 되어 있다. Trypanosomes는 또한 중요 하 고 흥미로운 연구 주제 때문에 그들은 생존 하 고 두 개의 매우 다른 환경에서 성장 하는 그들을 허용 하는 수많은 기계 장치를 고안 했다: 체체파?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD 대학교 드 보르도의 모든 회원을 감사합니다. 이 연구는 보르도의 대학에서 내부 자금에 의해 지원 되었다 및 지원 LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, ANR 및 협회에서 부 르 지속 가능성 드 라 검색 en parasitologie 외 두개골 트로피와 서비스 드 coopération 동부 표준시 d’action culturelle de l’Ambassade de 프랑스 à 방기 (Centrafrique).

Materials

10 mL Pipettes  Falcon 357,551
2 mL Pipettes  Falcon 352,507
Centrifugation tube 50 mL Falcon 352,070
Centrifuge Sigma Aldrich 4K15
DEAE cellulose Santa Cruz s/c- 211213 100 G
filter paper  Whatman 1,001,125
Flat bottom flask narrow neck Duran 21 711 76 6000 mL
Glucose  VWR 101174Y 500 G
Heparin Sigma Aldrich H3149-50KU 5 000 U
KH2PO4 VWR 120 26936.260 500 G
Microscope Olympus CH-20
Microscope coverslips Thermofisher scientific CB00100RA020MNT0
Microscope slides Thermofisher scientific AGAA000001
Na2HPO4  VWR 100 28026;260 500 G
NaCl VWR 27800.291 1 KG
NaH2PO4  VWR 110 33616;262 500 G
Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL Thermofisher scientific 342024-0125
Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL Thermofisher scientific 342024-0500
Pasteur Pipette VWR BRND125400
Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg EUROBIO CABPES01 OU 100 mL
Phenol red Sigma Aldrich P0290 100 mL
Syringue  Dutscher SS+10S21381
Tissue culture hood Thermoelectro Corporation MSC-12
Trypanosoma brucei brucei Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambiense Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). ITMAP 1893
Trypanosoma musculi London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) Partinico II

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Courtois, P., Nabos, P., Nzoumbou-Boko, R., Reix, C. E., Dauchy, F., Daulouede, S., Bringaud, F., Robinson, D. R., Vincendeau, P. Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns). J. Vis. Exp. (146), e58415, doi:10.3791/58415 (2019).

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