Summary

Indução de diferenciação endotelial em células progenitoras cardíacas sob condições de baixo de soro

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Este protocolo descreve uma técnica de diferenciação endotelial para células progenitoras cardíacas. Centra-se sobretudo em como concentração sérica e densidade de semeadura de célula afetam o potencial de diferenciação endotelial.

Abstract

Células progenitoras cardíacas (CPCs) podem ter um potencial terapêutico para regeneração cardíaca após lesão. No coração dos mamíferos adulto, CPCs intrínsecos são extremamente escassos, mas CPCs expandidas podem ser útil para terapia celular. Um pré-requisito para a sua utilização é a sua capacidade de se diferenciar de uma forma controlada nas várias linhagens cardíacas usando protocolos definidos e eficientes. Além disso, a expansão em vitro , CPCs isolaram de pacientes ou modelos pré-clínicos doença podem oferecer ferramentas de pesquisa proveitosa para a investigação dos mecanismos da doença.

Estudos atuais usam marcadores diferentes para identificar CPCs. No entanto, nem todos eles são expressos em seres humanos, que limita o impacto translacional de alguns estudos pré-clínicos. Protocolos de diferenciação que são aplicáveis independentemente da expressão técnica e marcador de isolamento permitirá a expansão padronizada e escorva do CPCs para efeito de terapia celular. Aqui descrevemos que escorva CPCs sob uma concentração baixa de soro fetal bovino (FBS) e as condições de densidade celular baixa facilita a diferenciação endotelial dos CPCs. usando dois diferentes subpopulações de rato e rato CPCs, mostramos que a laminina é uma mais substrato adequado que fibronectina para este fim, sob o seguinte protocolo: depois para 2-3 dias em média, incluindo os suplementos que manter multipotency de cultivo e com 3,5% FBS, CPCs são semeados na laminina em < 60% confluência e cultivadas em meio livre de suplemento com baixas concentrações de FBS (0,1%) por 20-24 horas antes de diferenciação num meio de diferenciação endotelial. Porque CPCs são uma população heterogénea, concentrações séricas e tempos de incubação podem precisar ser ajustada dependendo das propriedades da respectiva subpopulação de CPC. Considerando isso, a técnica pode ser aplicada a outros tipos de CPCs também e fornece um método útil para investigar o potencial e os mecanismos de diferenciação e como eles são afetados pela doença quando usando CPCs isoladas de modelos respectivos de doença.

Introduction

Estudos recentes suportam a existência de células progenitoras cardíacas residente (CPCs) no coração dos mamíferos adultos1,2,3, e CPCs poderiam ser uma fonte útil para terapia celular após lesão cardíaca4, 5. Além disso, CPCs expandidas podem fornecer um modelo frutífero para rastreio de drogas e a investigação dos mecanismos da doença quando isoladas de pacientes com miocardiopatias raras ou de doença respectiva modelos6,7.

PCC isolado do coração adulto possuem tronco/progenitoras célula características1,2,3,8 como eles são multipotentes, clonogenic, e têm a capacidade de auto-renovação. No entanto, há muitos diferentes (sub) populações CPCs exibindo perfis de marcador de superfície diferentes, incluindo, por exemplo, c-kit, Sca-1 e outros, ou obtida por técnicas de isolamento diferentes (tabela 1). Vários protocolos de cultura e diferenciação foram estabelecidas1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Estes protocolos variam principalmente no que diz respeito a fator de crescimento e teor de soro, que são ajustadas de acordo com a finalidade do cultivo e que pode levar a diferenças nos resultados e as consequências, incluindo a eficiência de diferenciação.

Técnicas de isolamento baseados no marcador:

PCC pode ser isolados com base em um marcador de superfície específicos expressão1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Estudos anteriores sugerem que a c-kit e Sca-1 podem ser os melhores marcadores para isolar residente CPCs1,11,14,19,20. Porque nenhum desses marcadores é verdadeiramente específico para CPCs, combinações de diferentes marcadores são geralmente aplicadas. Por exemplo, Considerando que CPCs expressam baixos níveis de c-kit21, c-kit é expressa também por outros tipos de células, incluindo mastócitos22, células endoteliais23e de células tronco/progenitoras hematopoiéticas24. Um problema adicional é o fato de que nem todos os marcadores são expressos através de todas as espécies. Este é o caso da Sca-1, que se expressa no rato mas não no humano25. Portanto, usar os protocolos que são independentes dos marcadores de isolamento pode ser vantajoso, tendo em conta os ensaios clínicos e estudos usando amostras humanas.

Técnicas de isolamento de marcador independente:

Existem várias técnicas principais de isolamento do CPC, que são principalmente independentes da expressão do marcador de superfície, mas que pode ser refinado pela seleção consecutiva do específicos marcador positivo subfractions conforme necessário (Veja também a tabela 1). (1) a técnica de população (SP) lado originalmente tem sido caracterizada em uma população primitiva de células-tronco hematopoiéticas baseado na capacidade de efluxo o corante de ADN Hoechst 3334226 de ATP-binding cassette (ABC) transportadores27. Células cardíacas de SP foram isoladas por diferentes grupos e relatadas para expressar uma variedade de marcadores com algumas pequenas diferenças entre relatórios2,8,13,14. (2) células de fibroblastos de unidade formadoras de Colônia (CFU-Fs) originalmente foram definidas com base em uma célula do estroma mesenquimal (MSC)-como fenótipo. MSCs isoladas são cultivadas em pratos para induzir a formação de colônia. Tais formadoras MSC-como CFU-Fs podem ser isolado do coração adulto e são capazes de se diferenciarem em linhagens cardíaca15. (3) Cardiosphere-derivado de células (CDC) são células únicas, derivadas de aglomerados de células cultivadas a partir de biópsias do tecido ou explants28,29,30,31. Recentemente foi demonstrado que, na maior parte o CD105+/CD90/c-kit fração de célula exibe cardiomyogenic e potencial regenerativo32.

Aqui, usando SP-CPCs isolados de ratos, nós fornecemos um protocolo para a indução eficiente da linhagem endotelial com base em um estudo anterior em CPCs de rato e rato SP-CPCs33. O protocolo contém adaptações específicas à cultura e técnica de expansão em relação a densidade celular, o soro que integram o meio e o substrato. Isso pode ser aplicado não só ao rato SP-CPCs mas para diferentes tipos de CPCs para o propósito para induzir um interruptor de destino de uma amplificação para um CPC endotelial-cometeu, seja tendo em conta o transplante dessas células ou sua utilização para estudos mecanicistas em vitro .

Protocol

O uso de ratos para efeito de isolamento de célula estava de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e com a lei Suíça de proteção Animal e foi aprovado pelas autoridades cantonais suíços. Nota: O isolamento da Sca-1+/CD31– SP-CPCs do coração de rato foi essencialmente feito como descrito anteriormente34 com algumas modificações. Para os materiais e reagentes usados, consulte Tabela de materiais</str…

Representative Results

Isolamento do CPC-SP de mouse: Neste estudo, nós usamos o CPCs de rato isolados de acordo com o fenótipo de SP, Considerando que os resultados do rato CPCs são modificados e adicionados de um relatório anterior com permissão (Figura 8)33. Proliferação de célula em célula de alta e baixa densidades e com concentra…

Discussion

Vantagens do presente protocolo:

Este protocolo fornece uma técnica de diferenciação endotelial do CPCs. Achamos que uma concentração sérica baixa e a densidade celular baixa podem melhorar a eficiência da diferenciação endotelial, pelo qual LN provou para ser um substrato mais adequado do que FN nestas condições. Nós usamos dois tipos distintos de CPCs: rato CPCs, que foram usados em uma maneira semelhante ao linha de celular e mouse SP-CPCs, que foram isoladas e expandido. Notavelme…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecer Vera Lorenz seu apoio útil durante as experiências e o pessoal da instalação de citometria de fluxo do departamento de Biomedicina (DBM), University e University Hospital Basel. Este trabalho foi apoiado pelo programa estadia-na pista da Universidade da Basileia (para Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster é suportado por uma concessão do Swiss National Science Foundation (número de concessão de 310030_156953).

Materials

Culture medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071 3.5% (0.1% for lineage induction)
L-Glutamine  ThermoFisher #25030 Final concentration 2 mM
Glutathione Merck #G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland #100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #14170
0.05 % Trypsin-EDTA ThermoFisher #25300
T75 Flask Sarstedt #83.3911
Endothelial differentiation  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) Medium ThermoFisher #21127
Laminin  Merck #L2020
Fibronectin  Merck #F4759 Dilute in ddH2O
6 Well Plate Falcon #353046
Formaldehyde Solution Merck #F1635 Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)
Triton X-100 Merck #93420 0.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%) ThermoFisher #50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibody Abcam #ab6994 1:100 in 10% goat serum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 ThermoFisher #A11010 1:500 in 10% goat serum
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) ThermoFisher #62247 1:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade Kit ThermoFisher #S2828
BX63 widefield microscope Olympus
Tube formation
96 Well Plate Falcon #353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap Falcon #352235
Matrigel Growth Factor Reduced Corning #354230
IX50 widefield microscope Olympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 
Reagents
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. in house hospital pharmacy #9077862 Working solution: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) ThermoFisher #14175 Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  for quenching Collagenase B activity 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate ThermoFisher #331885 Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
HEPES 1 M ThermoFisher #15630080 Final concentration 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
RBC LysisBuffer (10X) BioLegend #420301/100mL Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter
Collagenase B Merck #11088807001 Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) Merck #B2261 Prepare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride  Merck #V4629 Final concentration 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences #551262 0.25 µg/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) BD Biosciences #557405 0.6 µg/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD) ThermoFisher #A1310 0.15 µg/106cells
APC rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #553932 0.25 µg/107cells
FITC Rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #554688 0.6 µg/107cells
Material
Needles 27G Terumo #NN-2719R
Needles 18G Terumo #NN-1838S
Single Use Syringes 1 mL sterile CODAN #62.1640
Transferpipette 3.5 mL Sarstedt #86.1171.001
Cell Strainer 40 µm blue BD Biosciences  #352340
Cell Strainer 100 µm yellow BD Biosciences #352360
Lumox Dish 50 Sarstedt #94.6077.305
Culture Dishes P100 Corning #353003
Culture Dishes P60 Corning #353004
Mouse
Line Age Breeding
C57BL/6NRj / male 12 weeks in house
Product Name Company Catalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
L-Glutamine  ThermoFisher #25030
Glutathione Merck #G6013
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland  #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. 
Product Name Medium 18 Medium 2 Medium 3
Reagents Culture Lineage induction Endothelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 35% 35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham 65% 65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S) 1% 1%
Fetal Bovine Serum (FBS) 3.5% ≤0.1%
L-Glutamine  2 mM 2 mM
Glutathione 0.2 nM 0.2 nM
B27 Supplement 1.3%
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) 6.5 ng/mL
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) 13 ng/mL
Cardiotrophin 1  0.65 ng/mL

References

  1. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
  2. Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
  3. Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
  4. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  5. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
  6. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
  7. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
  8. Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
  9. Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
  10. El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
  11. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
  12. Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
  13. Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. 발생학. 265 (1), 262-275 (2004).
  14. Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
  15. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
  16. Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
  17. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  18. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
  19. Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
  20. Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
  21. Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
  22. Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
  23. Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
  24. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  25. Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  27. Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
  28. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
  29. Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
  30. Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks–an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
  31. Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
  32. Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
  33. Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
  34. Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
  35. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  36. Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).

Play Video

Cite This Article
Mochizuki, M., Della Verde, G., Soliman, H., Pfister, O., Kuster, G. M. Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58370, doi:10.3791/58370 (2019).

View Video