В естественных условиях Двух фотонных изображений корковых нейронов в новорожденных мышей
Summary
Мы представляем в естественных условиях двух фотонных изображений протокол для визуализации коры головного мозга у новорожденных мышей. Этот метод подходит для анализа динамики развития корковых нейронов, молекулярные механизмы, которые управляют нейрональных динамики и изменения в нейрональных динамика в модели заболеванием.
Abstract
Двух фотонных изображений является мощным инструментом для анализа нейронных цепей в мозге млекопитающих в естественных условиях . Однако ограниченное количество в vivo тепловизионные методы существуют для изучения мозговой ткани живых новорожденных млекопитающих. Здесь мы кратко протокол для визуализации отдельных корковых нейронов в живых новорожденных мышей. Этот протокол включает в себя следующие две методологии: (1) системе Сверхновая для разреженных и яркие маркировки корковых нейронов в развивающийся мозг и (2) хирургическая процедура для хрупких новорожденного череп. Этот протокол позволяет наблюдение временных изменений отдельных корковых невритов новорожденных этапах с высоким соотношением сигнал шум. Приклеенные этикетку клеток конкретных генов и нокаут также могут быть достигнуты путем объединения сверхновой РНК-интерференции и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена систем редактирования. Этот протокол может таким образом, использоваться для анализа динамики развития корковых нейронов, молекулярные механизмы, которые управляют нейрональных динамики и изменения в динамике нейронов в модели заболеванием.
Introduction
Точное проводки нейронных цепей в коре имеет важное значение для высших мозговых функций, включая восприятие, познание и обучения и памяти. Корковых цепи динамически уточняются во время послеродового развития. Исследования изучали процесс корковых цепи формирования с использованием гистологических и в пробирке анализа культуры. Однако динамика формирования цепи в жизни млекопитающих оставалась главным образом неизученными.
Двух Фотон микроскопии широко используется для анализа в vivo нейронных цепей в1,мозг взрослой мыши2. Однако из-за технических проблем, только ограниченное количество исследований рассматривались нейронные цепи формирования у новорожденных мышей. К примеру Каррильо et al. исполнил покадровой съемки восхождения волокна мозжечка в втором послеродовой неделю3. Portera-Кайо et al. сообщили изображений аксоны в коркового слоя 1 в первом послеродовой неделю4. В настоящем исследовании мы суммируем протокол для наблюдения слой 4 корковых нейронов и их дендритов новорожденных мышей. Результаты, полученные путем применения настоящего Протокола, которая включает в себя две методологии, сообщается в нашей недавней публикации5. Во-первых мы используем сверхновой вектор системы5,6 для маркировки отдельных нейронов в головном мозге новорожденных. В системе сверхновой флуоресцентных белков, используется для маркировки нейронов нокдаун гена клеток конкретных сменные и помечены и редактирования/нокаут анализы также возможны. Во-вторых мы описываем хирургическая процедура подготовки черепной окно в хрупких новорожденных мышей. Вместе эти методологии позволяют наблюдения в естественных условиях отдельных нейронов в мозге новорожденных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важнейшие шаги в протоколе и устранения неполадок:
Наиболее важным этапом протокола является удаление черепа (протокол шаг 3.2). После вставки лезвие бритвы часто придерживается Дура, вызывая дурального кровотечение и повреждение головного мозга. Этого можно избежать путе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят т. Сато, м. Kanbayashi и S. Kouyama за их технической помощи. Эта работа была поддержана JSP-страницы KAKENHI Грант номера JP15K14322 и JP16H06143, научный фонд Такэда, Уэхара Мемориальный фонд и проект совместных исследований Ниигата университета мозга исследовательский институт 2017-2923 (H.M.) и по KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 и JP15H04263 и Грант в научных исследований в области инноваций «Динамическое регулирование функции мозга на металлолом и построения системы» (JP16H06459) от МПКСНТ (T.I.).
Materials
| pK031. TRE-Cre | 저자 | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | 저자 | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | 저자 | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | 저자 | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | 저자 | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. 발생학. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
