Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상
Summary
우리는 현재 vivo에서 2 광자 영상 이미징 신생아 쥐의 대뇌 피 질에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 대뇌 피 질의 뉴런, 신경 역학 및 질병 모델에서 신경 역학에 변화를 제어 하는 분자 메커니즘의 발달 역학 분석에 적합 합니다.
Abstract
두 광자 영상 포유류 두뇌에 있는 신경 회로의 비보에 분석을 위한 강력한 도구입니다. 그러나, vivo에서 화상 진 찰 방법의 제한 된 수 라이브 신생아 포유류의 뇌 조직 검사에 대 한 존재 합니다. 여기 우리 생활 신생아 쥐에 있는 개별 대뇌 피 질의 신경 세포 이미징에 대 한 프로토콜을 요약 합니다. 이 프로토콜 다음 두 가지 방법론을 포함 한다: (1) 초신성 시스템 스파스 하 고 밝은 개발 두뇌에 연약한 신생아 두개골에 대 한 수술 (2)는 대뇌 피 질의 뉴런의 라벨에 대 한. 이 프로토콜에는 높은 신호 대 잡음 비율 신생아 단계 개별 외피 neurites의 시간적 변화 관찰 수 있습니다. 레이블이 지정 된 셀 특정 유전자 침묵 및 녹아웃 RNA 간섭 및 편집 시스템 CRISPR/Cas9 유전자는 초신성을 결합 하 여 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 수 있습니다, 따라서, 대뇌 피 질의 뉴런, 신경 역학 및 질병 모델에서 신경 역학에 변화를 제어 하는 분자 메커니즘의 개발 역학을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
대뇌 피 질에 있는 신경 회로의 정확한 배선 지 각, 인식, 그리고 학습 및 메모리를 포함 하 여 더 높은 두뇌 기능을 위해 필수적 이다. 대뇌 피 질의 회로 출생 후 개발 하는 동안 동적으로 정제 된 있다입니다. 조직학 대뇌 피 질의 회로 형성을 사용 하 여 프로세스와 문화 분석 생체 외에서 연구 조사 했습니다. 그러나, 생활 포유류에 회로 형성의 역학 미개척 주로 남아 있다.
두 광자 현미경은 성인 마우스 뇌1,2에 있는 신경 회로의 분석 vivo에서 널리 사용 되었습니다. 그러나, 때문에 기술 과제, 연구의 제한 된 수만 언급 신생아 쥐에 있는 신경 회로 형성. 예를 들어 Carrillo 외. 두 번째 출생 후 주3에서 소 뇌에 섬유를 등반의 시간 경과 영상 수행. Portera-리아우 외. 첫 번째 출생 후 주4에서 대뇌 피 질의 레이어 1에에서 축 삭의 영상 보고. 현재 연구에서 우리는 계층 4 대뇌 피 질의 뉴런을 신생아 쥐에 있는 그들의 dendrites의 관찰에 대 한 프로토콜 요약. 두 가지 방법론을 포함,이 프로토콜을 적용 하 여 얻은 결과 우리의 최근 게시5에 보고 됩니다. 첫째, 초신성 벡터 시스템5,6 사용 하 여 개별 신경 신생아 두뇌의 라벨에 대 한. 초신성 시스템에서 신경 라벨에 사용 되는 형광 단백질 교환 및 레이블이 셀 특정 유전자 최저 이며 편집/녹아웃 분석은 또한 가능. 둘째, 우리는 연약한 신생아 쥐에 있는 두개골 창 준비에 대 한 수술을 설명합니다. 함께, 이러한 방법론 신생아 두뇌에 개별 뉴런의 vivo에서 관찰 하실 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜의 중요 한 단계 문제 해결:
프로토콜의 가장 중요 한 단계는 두개골 (프로토콜 단계 3.2)의 제거 이다. 삽입 시 면도날 종종 경 막 출혈과 뇌 손상을 일으키는 경질을 준수 합니다. 이 두개골에 피 질 버퍼의 한 방울을 추가 하 고 피 질 버퍼에 두개골을 제거 하 여 방지할 수 있습니다.
윈도우의 폐색 이끌어 낸다 두개골 창 준비 후 경질, 피부에서 출?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그들의 기술 지원에 대 한 T. 사토, M. Kanbayashi, S. Kouyama을 감사합니다. 이 작품 JSP KAKENHI 보조금 번호 JP15K14322 및 JP16H06143, 다케다 과학 재단, 우에하라 기념 재단, 그리고는 공동 연구 프로젝트의 니이가타 대학 뇌 연구 연구소 2017-2923 (흠)와 의해 지원 되었다 KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, 및 JP15H04263 및 그랜트에 과학에 대 한 연구 혁신 분야 “스크랩 및 빌드 시스템에 의해 뇌 기능의 동적 규칙” (JP16H06459)에서 문 부 과학성 (릭).
Materials
| pK031. TRE-Cre | 저자 | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | 저자 | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | 저자 | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | 저자 | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | 저자 | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. 발생학. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
