Summary

ליפוזומים antigenic לדור של נוגדנים מחלות ספציפיות

Published: October 25, 2018
doi:

Summary

המתואר הוא הכנת חלקיקים liposomal antigenic והשימוש שלהם עירור תאי B הפעלה במבחנה וב -vivo. תגובות נוגדנים חזקים ועקביים הוביל את הפיתוח של מודל חדש של אלרגיה לבוטנים. הפרוטוקול עבור יצירת ליפוזומים antigenic ניתן להרחיב אנטיגנים שונים ומודלים חיסונים.

Abstract

תגובות נוגדנים לחסינות קריטי מגן מגוון רחב של פתוגנים. יש עדיין עניין גבוהה על מנת לייצר נוגדנים חזקים לקבלת חיסון כמו גם להבין נוגדנים פתוגניים איך לפתח תגובות אלרגיות ומחלות אוטואימוניות. יצירת תגובות חזקות נוגדן אנטיגן ספציפי אינה טריוויאלית תמיד. במודלים של העכבר, זה דורש לעיתים קרובות מספר סיבובים של החיסונים עם אדג’וונט שמוביל כמות גדולה של השתנות רמות נוגדנים המושרה. דוגמה אחת היא במודלים של העכבר של אלרגיות בוטנים שם יותר חזקים לשחזור דגמים למזער מספרים העכבר ושימוש אדג’וונט יהיה מועיל. המוצג כאן הוא מודל העכבר מאוד לשחזור של אלרגיה לבוטנים אנפילקסיס. זה הדגם החדש מתבסס על שני גורמים מרכזיים: splenocytes (1) אנטיגן ספציפי הם adoptively מ רגיש-בוטן העכבר לתוך עכבר תמים הנמען, נרמול המספר של אנטיגן ספציפי זיכרון ו- T-לימפוציטים על פני מספר רב של עכברים; עכברים הנמען (2) הן לאחר מכן שיפרה עם immunogen multivalent חזק בצורה של חלקיקים liposomal הצגת האלרגן בוטנים הגדולות (Ara h 2). היתרון העיקרי של מודל זה הוא הפארמצבטית שלה, אשר בסופו של דבר מפחיתה את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים במחקר כל, תוך צמצום מספר החיות מקבלים זריקות מרובות של אדג’וונט. מכלול מודולרי של אלה ליפוזומים immunogenic מספק הסתגלות יחסית נתיישב דגמים אחרים אלרגי או אוטואימוניות המערבות נוגדנים פתוגניים.

Introduction

אלרגיה למזון משפיע על 8% של ילדים בארצות הברית, עלה בשכיחות במהלך העשור1. אלרגיה בוטנים משפיע על 1% של ילדים ואינו בדרך כלל גדולים מדי.2. למרות מספר ניסויים קליניים מבטיח נערכים לטיפול של אלרגיה למזון, כולל אוראלי חיסוני (אוקיאנה), sublingual חיסוני (חריץ) חיסוני epicutaneous (EPIT), יש כיום אין טיפול שאושרו על-ידי ה-FDA אסטרטגיות עבור הרגישות יחידים בוטנים-אלרגית3,4,5,6,7,8. לכן, אנשים אלרגית אך ורק עליך להימנע אלרגנים להתחמק אנפילקסיס. שאלות רבות נותרו לגבי מסלולים של רגישות עולה, שבבסיס מנגנוני התפתחות אלרגיה למזון.

העכבר הן כלי רב ערך עבור הלומדים את המנגנונים של אלרגיה, כמו גם פיתוח חדש tolerogenic הקהיה טיפולים9,10,11,12. זה נכון במיוחד כי האלרגן בוטנים הגדולות (Ara h 2; Ah2) אצל בני אדם הוא גם האלרגן דומיננטי בכמה תיאר העכבר מודלים13,14. בעוד העכבר מודלים של אלרגיה לבוטנים בפז בלימוד מנגנונים של רגישות עולה וסובלנות, חיסרון הוא כי הם יכולים להיות משתנה, דורשים שימוש adjuvants. Immunogens יותר חזק תהיה דרך אחת כדי למזער את ההשתנות מהותי של מודל שכזה. מאז B-תאים מופעלים בחוזקה על ידי אנטיגנים multivalent, ליפוזומים antigenic הצגת האלרגן הם אפשרות טובה בשל יכולתם להפעלת פוטנציאל תאי-B באמצעות הקולטן B-cell (BCR), בעוד גם יש את המאפיין של יעילות הטרמה תא T-cell דרך נלקח הלא ספציפית על ידי אנטיגן תאים.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור conjugating חלבונים אנטיגניים כדי liposomal חלקיקים באמצעות אסטרטגיה נתיישב ומודולרית. שימוש של הפונדקאית אנטיגן, מקטע Fab אנטי-IgM, נדגים כיצד חזק ליפוזומים antigenic כזה יכול להיות מגרה הפעלה B-cell. ליפוזומים antigenic הצגת אנטיגן Ah2 שימשו כדי לפתח מודל חדש עכבר שהוענקו רגישות. במודל זה, splenocytes מן מאומת עכברים אלרגית בוטנים, המכיל בוטנים ספציפיות זיכרון ו- T-לימפוציטים, מועברים לתוך תמים congenic עכברים. תגובות נוגדנים זיכרון הם המושרה על ידי הזרקה של ליפוזומים מצומדת עם Ah2 לתוך העכברים הנמען, לשם הפקת נוגדנים נגד Ah2. ואחריו דחיפה אחת בלבד עם Ah2 מסיסים, נוגדנים ספציפיים Ah2 להצמיח אנפילקטי תגובה חזקה כאשר אלו עכברים מאותגרים לאחר מכן עם Ah2. עכברים שעברו התגובה האלרגית מגיבים בצורה מאוד אחידה, לא קיבלו את אדג’וונט, גישה זו הוא מודל רצוי אלרגיה לבוטנים, התוצאות מציע כי זה יכול להיות כלי במודלים אחרים של העכבר מונע על ידי אנטיגנים מכוונת אלרגנים ואולי גם autoantigens.

Protocol

השיטה הכללית מצמד חלבונים שומנים בדם, שילוב ליפוזומים מבוססת במידה רבה על עבודה קודמת15. כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים להלן אושרו על ידי מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ’אפל היל מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC). כל העכברים השתמשו במודל לבוטנים הן נקבות BALB/cJ שנרכשו רוב בגי…

Representative Results

ניתן להדגים ההטיה של החלבון עניין עם DSPE-PEG(2000) על-ידי הפעלת תוך צמצום מראה עלייה משקל מולקולרי בהשוואה החלבון unconjugated. איור 1A מציג ג’ל נציג של העכבר אנטי IgM F(ab) פרגמנט ההטיה כדי פג-DSPE, אשר מראה על 2-3 kDa bandshift עבור החלבון denatured. שימו לב כי כ- 50% של החלבון מופיע כדי לה…

Discussion

השיטות המתוארות כאן הם עבור הבניין של חלבון כדי ליפופרוטאין אשר מאפשר את התצוגה של החלבון על חלקיקים liposomal פרוטוקול כללי. חלבונים יחידה משנית ריבוי גדול מאוד, פרוטוקול זה תהיה מוגבלת השירות. השיטה האידיאלי יהיה המבוא של תג בייעודי לאתר המאפשר אסטרטגיה כימי biorthogonal קישור לשמש. אם המבטאת את ה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים משרד ההגנה (W81XWH-16-1-0302 ו- W81XWH-16-1-0303).

Materials

Model 2110 Fraction Collector BioRad 7318122
Cholestrol Sigma C8667 Sigma grade 99%
SPDP Thermo Fisher Scientific 21857
DSPC Avanti 850365
DSPE-PEG 18:0 Avanti 880120
DSPE-PEG Maleimide Avanti 880126
Extruder Avanti 610000 1mL syringe with holder/heating block
Filters 0.1 µm Avanti 610005
Filters 0.8 µm Avanti 610009
10mm Filter Supports Avanti 6100014
Glass Round Bottom Flask Sigma Z100633
Turnover stoppers Thermo Fisher Scientific P-301398
Tubing Thermo Fisher Scientific P-198194
Leur Lock Thermo Fisher Scientific k4201634503
Sephadex G50 Beads GE Life Sciences 17004201
Sephadex G100 Beads GE Life Sciences 17006001
Heat Inactivated Fetal Calf Serum Thermo Fisher Scientific 10082147
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080
EGTA Sigma E3889
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
1x RBC lysis Buffer Thermo Fisher Scientific 00-4333-57
Indo-1 Invitrogen I1203
CD5-PE BioLegend 100608
B220-PE-Cy7 BioLegend 103222
HBSS Thermo Fisher Scientific 14170112 without calcium and magnesium
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C4901
Fab anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-007-020
F(ab')2 anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-006-020
Peanut flour Golden Peanut Co. 521271 12% fat light roast, 50% protein
Animal feeding needles Cadence Science 7920 22g x 1.5", 1.25 mm – straight
Microprobe thermometer Physitemp BAT-12
Rectal probe for mice Physitemp Ret-3
Cholera toxin, from vibrio cholera List Biological Laboratories, Inc. 100B Azide free
BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
Carbonate-bicarbonate buffer Sigma C3041
TMB Stop Solution KPL 50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 5120-0077
96 well Immulon 4HBX plate Thermo Scientific 3855
Purified soluble Ara h 2 N/A N/A purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNP Sigma A-6661
Mouse IgE anti-DNP Accurate Chemical BYA60251
Sheep anti-Mouse IgE The Binding Site PC284
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG Accurate Chemical JNS065003
NeutrAvidin Protein, HRP ThermoFisher Scientific 31001
Mouse IgG1 anti-DNP Accurate Chemical MADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1 Southern Biotech 1070-05
1 mL Insulin Syringes BD 329412 U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-14 25 x 75 x 1.0 mm
ACK Lysing Buffer gibco by Life Technologies A10492-01 100 mL
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093 500 mL
Cell Strainer Corning 352350 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Invitrogen NP0322BOX 10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4X Invitrogen NP0008 250 mL
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard Invitrogen LC5925 500 µL
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X Invitrogen NP0002 500 mL
GelCode Blue Stain Thermo Scientific 24590 500 mL

References

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
  3. Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
  4. Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
  5. Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
  6. Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
  7. Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
  8. Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
  9. Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
  10. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  11. Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
  12. Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
  13. Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
  14. Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
  15. Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
  16. Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
  17. Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
  18. Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
  19. Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
  20. LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
  21. Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
  22. Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
  23. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
  24. Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
  25. Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
  26. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  27. Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).

Play Video

Cite This Article
Bednar, K. J., Hardy, L., Smeekens, J., Raghuwanshi, D., Duan, S., Kulis, M. D., Macauley, M. S. Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies. J. Vis. Exp. (140), e58285, doi:10.3791/58285 (2018).

View Video