ويرد نموذج ثقافة طويلة الأجل للخلايا granulosa الأبقار تحت ظروف خالية من المصل. هذا النموذج يسمح للباحثين لدراسة آثار مختلف العوامل والظروف ككثافة الطلاء المختلفة على خصائص الإستروجين المنتجة للخلايا granulosa الأبقار.
الخلايا granulosa المبيض (GC) هي المصدر الرئيسي لتوليف استراديول. الناجمة عن الزيادة preovulatory الهرمون (LH)، الخلايا في القراب، وعلى وجه الخصوص، في طبقة الخلايا granulosa عميقا تغيير خصائصها المورفولوجية والفسيولوجية والجزيئية وتشكيل مجموعة إنتاج البروجسترون أصفر هو المسؤول عن الحفاظ على الحمل. خلية ثقافة النماذج أدوات أساسية دراسة الآليات التنظيمية الأساسية المشاركة في التحول اللواتي فوليكولو. ويركز البروتوكول قدم على إجراءات العزل ونعد GC الأبقار من المسام الصغيرة إلى متوسطة الحجم (< 6 مم). مع هذه التقنية، يمكن الحصول على عدد سكان تقريبا نقية من GC. إجراءات تجميد يسهل إلى حد كبير الوقت إدارة خلية ثقافة العمل المستقل إمداد الأنسجة (المبايض) الابتدائية مباشرة. ويصف هذا البروتوكول نموذج ثقافة خلية خالية من المصل الذي يحاكي حالة نشطة استراديول GC الأبقار. وتناقش الشروط الهامة التي ضرورية لثقافة نجاح الستيرويد نشطة خلية في جميع أنحاء البروتوكول. ثبت أن زيادة كثافة الطلاء من الخلايا يستحث استجابة محددة كما هو مبين بجينات تغيير تعبير الشخصية وهرمون إنتاج. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا النموذج أساسا لإجراء مزيد من الدراسات على التمايز GC والتطبيقات الأخرى.
نجاح التبويض ولوتينيزيشن تعتمد على التعديلات الجزيئية ناعما ضبطها ومدبرة جيدا في أنواع مختلفة من الخلايا الجرابية جسدية. منذ تفاصيل هذه العمليات الإنمائية هي لم لم تفهم تماما، كذلك مطلوب التوضيح. في فيفو النهج معقدة ومكلفة، وعلى وجه الخصوص، تفشل بعنوان الآليات الجزيئية المحددة التي تحدث أثناء فوليكولوجينيسيس. ولذلك، يلزم نماذج ريدوكتيونيستيك في المختبر بالإضافة إلى ذلك، لتقديم نظرة ثاقبة تفاصيل الخلوية والجزيئية. تصف دراسات مختلفة ثقافة المسام كله في سياق2،1، في المختبر التسميد تقنيات3. نظراً للباحثين المهتمين في آليات التمايز، تركز العديد من الدراسات على GC الحبيبي. هذه الخلايا، ترتبط ارتباطاً مباشرا بويضتها، هي المصادر الرئيسية لإنتاج الإستروجين، وهكذا، تلعب دوراً أساسيا في جميع أنحاء فوليكولوجينيسيس ولوتينيزيشن4.
خلد الخلية وضعت خطوط GC من مختلف الأنواع. معظمها، ومع ذلك، لا تظهر إنتاج هرمون ستيرويد كافية5. حتى الآن، إنشاء خط خلية واحدة فقط من الأبقار كانت GC6، ولكن هذا الخط فقدت نشاطها ستيرويدوجينيك بعد عدة ممرات7. ولذلك، منذ ستيرويدوجينيسيس، وخاصة، إنتاج استراديول سمة أساسية من وظائف القيادة العامة، ينصح بدراسة هذه الجوانب في نماذج الثقافة الخلية الأولية. في دراسات سابقة، اتضح أن إنتاج استراديول كبيرة يمكن ملاحظتها فقط تحت شروط ثقافة خالية من المصل8،9. كذلك، المكملات للسلائف التوليف استراديول شرط أساسي آخر، كما تفشل GC للتعبير عن إنزيم اللازمة التي يمكن تحويل البروجسترون إلى التشتوستيرون10. بالإضافة إلى ذلك، كشفت أثر التآزري FSH، ومنتدى إدارة الإنترنت-1 مكملات في المختبر نشاط أمثل من أروماتاسي، الإنزيم الرئيسية من استراديول التوليف11. ويرد أيضا في هذا البروتوكول، العوامل الهامة الأخرى التي لها تأثير كبير على نموذج الثقافة GC. على وجه الخصوص، الخلية تصفيح كثافة آثار هائلة على نتائج التجربة12. وعلاوة على ذلك، يمكن إنشاء أسلوب نعد من GC الأبقار التي لا تتداخل إلى حد كبير مع فسيولوجيا GC في الثقافة. هذه التقنية تساعد على تحسين تنظيم خلية ثقافة العمل وتحسين كثافة الطلاء المفضل.
نموذج الثقافة عرض الخلية يوفر أداة لتحليل granulosa الخلية التمايز في المختبر. أظهرت العديد من الدراسات أن زراعة خالية من المصل شرط أساسي للحفاظ على نشاط ستيرويد في GC البقري مثقف أو GC من سائر الأنواع8،9. بالإضافة إلى ذلك، طلاء الطبق الثقافة مع عناصر المصفوفة خارج الخلية (مثلاً، الكولاجين R)13، تحسنا عن ارتباط الخلايا. ميزة هامة أخرى هي فترة طويلة الثقافة. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت أن ثقافة طويلة الأجل أمر ضروري للحصول على نشاط ستيرويدوجينيك كافية وتعبير عن granulosa الخلية هوية علامات17بشكل متوازن. ويبدو أن GC تتطلب الوقت للتعافي من الإجهاد البدني أثناء إجراء العزل.
مثقف الملاحق الإعلامية FSH، ومنتدى إدارة الإنترنت-1، والتشتوستيرون معروفة للحث على النشاط aromatase في GC. خصوصا، المكملات مع التشتوستيرون ضروري تماما، ك GC حاجة تمهيدا لتوليف استراديول. هذا وقد نشرت سابقا11،18 ، وعليه، كان لا مزيد من التحقيق خلال هذه الدراسة. ومع ذلك، قد يكون من الضروري لمجموعة عمليات تجريبية أخرى لتكيف من FSH، ومنتدى إدارة الإنترنت-1، وتركيزات التشتوستيرون.
للواسمات الأسلوب الموصوفة هنا يمكن أن تساعد على تحسين تنظيم تجارب زراعة الأنسجة بجعلها أكثر استقلالاً من إمدادات متفاوتة مع المبايض. ووفقا للتجارب السابقة، لا يؤثر نعد GC النمط الظاهري أو إنتاج المنشطات في الثقافة. أيضا، وفرة محاضر مبرز في الخلايا المستزرعة لم يكشف عن فروق كبيرة مقارنة العينات إعداد من الخلايا المعزولة حديثا مع الذين تعرضوا سابقا لتجميد16.
معلمة حاسمة للنموذج الحالي للثقافة GC هي الخلية تصفيح الكثافة. كما يتضح من نتائج الممثل، زيادة كثافة الطلاء الناجمة عن تغيرات ملحوظة في الخصائص الفسيولوجية والجزيئية. وتخضع العديد من الجينات بطريقة محددة، تشبه التغيرات التي هي فعل التحفيز LH في فيفو4،19. حقيقة أنه بازدياد كثافة خلية يمكن أن تدفع العمليات الشبيهة بالتمايز في GC البقري مثقف بدقة النظر في هذا GC في المختبر النموذجي لتجنب النتائج المتضاربة بين replicates. ولذلك، نتائج متناقضة مع دراسات أخرى يمكن أن يعزى إلى كثافات مختلفة الخلية وينبغي أن تدرس على نحو أوثق.
نموذج الثقافة الموصوف هنا كشفت عن عدم الاستجابة لله، كمحاضر مستقبلات لهكجر بالقرب من حد الكشف. ومن ثم محاكاة LH الطفرة على حد سواء الوضع في فيفو فشل للحث على التمايز13. على الرغم من ذلك، هذا النموذج يوفر أداة مفيدة لدراسة GC استراديول-نشطة في الثقافة الأولية، وخطوط GC البقري خاصة الوظيفية كما لا توجد في الوقت الحاضر.
ويمكن اختبار بروتوكولات العلاج المختلفة في النموذج الحالي للثقافة GC التي تساعد على كشف الآليات التنظيمية لإنتاج الستيرويد أو التمايز GC. علاوة على ذلك، واحدة من العوامل التي تشارك في العمليات الإنمائية يمكن تحليلها بشكل منفصل. ولذلك، يوفر هذا الطراز الثقافة أساسا للعديد من التطبيقات المختلفة.
The authors have nothing to disclose.
ونشكر شريتير فيرونيكا لها المساعدة التقنية الممتازة وتعديلات مفيدة نموذج الثقافة التقنية وخلية للواسمات الراسخة. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر أندرس الإيطاليون وروديوالد سوانهيلد لمساعداتها التقنية ممتازة في التحليل اللاحق.
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |