Summary

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

Published: August 22, 2018
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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.

Abstract

Cuantificación de la activación de las células T CD4 Naive, proliferación y diferenciación al ayudante de T 1 (Th1) las células es una manera útil de evaluar el papel desempeñado por las células T en una respuesta inmune. Este protocolo describe la diferenciación en vitro de progenitores de médula ósea (MO) para la obtención de granulocitos macrófago colonia-que estimulan el factor (GM-CSF) deriva-células dendríticas (DCs). El protocolo describe también la transferencia adoptiva de péptidos de ovoalbúmina (OVAp)-cargado DCs de GM-CSF-derivados e ingenuo CD4 T cells de ratones transgénicos OTII para analizar la en vivo la activación, proliferación y diferenciación de Th1 de la transferidos de las células T CD4. Este protocolo evita la limitación de puramente en vivo los métodos impuestos por la imposibilidad de manipular o seleccionar la población celular estudiado específicamente. Además, este protocolo permite estudios en un ambiente en vivo , evitando alteraciones a factores funcionales que pueden ocurrir en vitro e incluyendo la influencia de los tipos de la célula y otros factores que sólo se encuentran en órganos intactos. El protocolo es una herramienta útil para generar cambios en DCs y células de T que modificar las respuestas de adaptación inmune, potencialmente proporcionando importantes resultados para entender el origen o el desarrollo de numerosas enfermedades asociadas inmunes.

Introduction

Las células T CD4 y el antígeno que presenta las células (APCs) como DCs son necesarios mediadores de inmunidad a patógenos microbianos1,2. En los órganos linfoides periféricos, se activan las células T CD4 a partir del reconocimiento de antígenos específicos presentados por APCs3,4,5. Las células T CD4 activadas proliferan y se diferencian en células de Th de distintos efectores específicos que son necesarias para el desarrollo de una correcta respuesta inmune adaptativa6,7. Control de estos procesos es fundamental para producir una defensa adaptativa adecuada que mata el patógeno sin producir tejido dañino daño8. Las células TH se definición según la expresión o producción de moléculas de superficie, factores de transcripción y citoquinas efectoras y funciones esenciales y precisos en respuesta a patógenos1. Células del subconjunto de células Th1 expresan el factor de transcripción T-bet y la citocina interferón γ (IFNγ) y participan en la defensa del huésped contra patógenos intracelulares1. Cuantificación de la activación de las células T CD4 Naive, proliferación y diferenciación de Th1 es un medio útil de evaluar el papel T que desempeñan las células en una respuesta inmune.

Este protocolo permite in vivo análisis de la capacidad de in vitro –generan derivados de BM DCs para modular la activación, proliferación y diferenciación de Th1 de las células CD4 naïve. El protocolo sirve también para evaluar la capacidad de las células de T CD4 ingenuo para ser activado, induce a proliferar, y Th1 diferenciadas (figura 1). Este protocolo versátil sortea la incapacidad para manipular o seleccionar la población de células estudiadas en puramente en vivo protocolos específicamente. Los efectos de diversas moléculas y tratamientos por el DCs pueden ser estudiados mediante BM de ratones modificados genéticamente5 o tratar o manipular genéticamente aislado de células BM9. Del mismo modo, las respuestas de células T pueden ser exploradas mediante la obtención de las células T para la transferencia adoptiva de diferentes fuentes o después de varias manipulaciones3,8,10.

Las principales ventajas de este protocolo son dos. Activación de la célula de t, la proliferación y diferenciación de Th1 se analizan con un enfoque de citometría de flujo; y esto se combina con en vivo estudios, evitando así alteraciones que pueden ocurrir en vitro y como tipos de la célula y otros factores que sólo se encuentran en órganos intactos11.

El uso de colorantes vitales es una técnica ampliamente utilizada para rastrear la proliferación celular, evitando el uso de la radiactividad. La medición de la proliferación con estos reactivos se basa en la dilución del colorante después de la división celular. Además, estos tintes pueden detectarse en varias longitudes de onda y son fácilmente analizados por citometría de flujo en combinación con múltiples anticuerpos fluorescentes o marcadores. Destacamos la utilidad de este protocolo, mostrando cómo la activación de células T, la proliferación y diferenciación de Th1 pueden ser analizadas por citometría de flujo.

Protocol

Procedimientos experimentales fueron aprobados por la Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) y la Comunidad Autónoma de Madrid con arreglo a las directrices españolas y europeas. Ratones fueron criados en la condiciones libres de patógenos específicos (SPF) y fueron sacrificados por la inhalación de dióxido de carbono (CO2). 1. aislamiento de células de médula ósea de ratón de Tibias y fémures Nota: La ce…

Representative Results

La figura 1 ilustra los pasos descritos en este protocolo. La figura 2 ilustra el aislamiento y cultivo de células de ratón BM. La adición de GM-CSF y LPS a estas culturas permite la generación en vitro y la maduración de DCs. figura 3 ilustra el análisis de citometría de flujo de la diferenciación y maduración de las DCs obtenidos cargado DCs. OVAp derivadas de GM-CSF BM y aisladas…

Discussion

Este protocolo permite la caracterización de la capacidad de derivados de BM DCs para modular la activación, proliferación y diferenciación de las células CD4 naïve. Además, puede también utilizarse para evaluar la susceptibilidad de las células T CD4 a modulación por DCs derivados de BM. Con este protocolo, cambios en estos eventos pueden ser medidos en vivo.

Según la hipótesis de la investigación, se pueden utilizar varias combinaciones de células T y DCs. Por ejemplo,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Simon Bartlett para la edición de inglés. Este estudio fue apoyado por becas del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), el programa de Miguel Servet y la Fundación Ramón Areces; con la cofinanciación del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). El CNIC es apoyado por el Ministerio de economía, industria y competitividad (MEIC) y la Fundación Pro CNIC y es un centro de excelencia Severo Ochoa (SEV-2015-0505). RTF es fundado por la Fundación Ramón Areces y CNIC, VZG por el ISCIII, BHF por Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) y JMG-G por el ISCIII Miguel Servet programa y imas12.

Materials

Ethanol VWR Chemicals 20,824,365 5 L
Scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 14001-12
Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11000-13
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11253-20
Scalpel Fine Science Tools (F.S.T.) 10020-00 Box of 100 blades
Fetal Bovine Serum SIGMA F7524
Penicillin/streptomycin LONZA DE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) GIBCO 21875-034
Sterile Petri dishes Falcon 353003
25-gauge needle BD Microlance 3 300600
1 ml syringe Novico N15663
15 ml conical tubes Falcon 352096
50 ml conical tubes Falcon 352098
70 μm nylon web filter BD Falcon 352350
Red blood lysis buffer SIGMA R7757 100 Ml
EDTA SIGMA ED2SS-250
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906 100 g
Trypan blue SIGMA 302643-25G
Culture-plates Falcon 353003
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Cambrex BE17-737E
Beta-mercaptoethanol Merck 8-05740-0250
Sodium pyruvate LONZA BE13-115E
L-glutamine LONZA BE17-605E
Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Prepotech 315-03
lipopolysaccharide (LPS) SIGMA-ALDRICH L2018
96-well-plate Costar 3799
v450 anti-mouse CD11b antibody BD Biosciences 560455
PE anti-mouse CD64 antibody BioLegend 139303
PE anti-mouse CD115 antibody BioLegend 135505
FITC anti-mouse CD11c antibody BioLegend 117305
FITC anti-mouse MHCII antibody BioLegend 125507
APC anti-mouse CD86 antibody BioLegend 105011
APC anti-mouse CD80 antibody BioLegend 104713
Flow Cytometry tubes Zelian 300800-1 PS 12X75 5mL
OTII Ovoalbumine peptide InvivoGen 323-339
anti-mouse biotinylated CD8α antibody Tonbo Biosciences 30-0081-U500
anti-mouse biotinylated IgM antibody BioLegend 406503
anti-mouse biotinylated B220 antibody Tonbo Biosciences 30-0452-U500
anti-mouse biotinylated CD19 antibody Tonbo Biosciences 30-0193-U500
anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody BioLegend 115302
anti-mouse biotinylated CD11b antibody Tonbo Biosciences 30-0112-U500
anti-mouse biotinylated CD11c antibody BioLegend 117303
anti-mouse biotinylated CD44 antibody BioLegend 103003
anti-mouse biotinylated CD25 antibody Tonbo Biosciences 30-0251-U100
anti-mouse biotinylated DX5 antibody BioLegend 108903
streptavidin-coated magnetic microbeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-101
Magnetic cell separator MACS Miltenyi Biotec 130-090-976 QuadroMACS Separator
Separation columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
PE anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100408
APC anti-mouse CD3 antibody BioLegend 100235
FITC anti-mouse CD8 antibody Tonbo Biosciences 35-0081-U025
Cell Violet Tracer Thermofisher C34557
APC anti-mouse CD25 antibody Tonbo Biosciences 20-0251-U100
Alexa647 anti-mouse CD69 antibody BioLegend 104518
PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 65-0453
APC anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 20-0453
PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 60-0453
FITC anti-mouse CD45.2 antibody Tonbo Biosciences 35-0454
Ionomycin SIGMA-ALDRICH I0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) SIGMA P8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD 555029
Paraformaldehyde Millipore 8-18715-02100
Intracellular permeabilization buffer eBioscience 00-8333
APC anti-mouse IFNg antibody Tonbo Biosciences 20-7311-U100
Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161-U100
B6.SJL CD45.1 mice The Jackson Laboratory 002014
BD LSRFortessa™ Cell Analyzer BD Biosciences 649225
DAPI Solution Thermofisher 62248

References

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Cite This Article
Toribio-Fernandez, R., Zorita, V., Herrero-Fernandez, B., Gonzalez-Granado, J. M. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (138), e58118, doi:10.3791/58118 (2018).

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