Summary

Un haut débit Cre-Lox activé Membrane virale Fusion test afin d’identifier les inhibiteurs de la Fusion membranaire virale du VIH-1

Published: August 14, 2018
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Summary

Nous décrivons un essai pour signaler sur la fusion VIH-1 par l’expression de la protéine fluorescente verte détectable par microscopie à écoulement cytometry ou fluorescence cellulaire. Il peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule.

Abstract

Ce test est conçu pour rapport spécifiquement sur le VIH-1 fusion via l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) détectable par microscopie à écoulement cytometry ou de fluorescence. Un virus VIH-1 de la journaliste (VIH-1 Gag-iCre) est généré en insérant une recombinase Cre dans le génome du VIH-1 entre la matrice et les protéines de la capside de la polyprotéine Gag. Il en résulte dans un emballage de recombinase Cre en particules de virus, qui est ensuite libéré dans une cellule cible ligne exprimant de manière stable une Cre activés par recombinase rouge protéine fluorescente (DP) à cassette de commutateur GFP. À l’état basal, cette cassette exprime DP uniquement. Suite à la livraison de la recombinase Cre dans la cellule cible, la DP, flanquée de sites loxP, accises, aboutissant à l’expression de la GFP. Ce test peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule et a été utilisé pour identifier une classe des antagonistes des récepteurs purinergiques comme nouveaux inhibiteurs de la fusion de la membrane virale VIH-1.

Introduction

La nécessité de nouveaux antirétroviraux a incité le développement d’écrans de haut débit pour les inhibiteurs d’entrée du VIH-1. Le dosage de journaliste Gag-iCre est élaboré pour identifier les inhibiteurs d’entrée virale à l’étape de fusion dans un système de cellule à cellule infection en mesurant précisément fusion membrane virale avec la membrane de la cellule hôte1. Un essai a été développé pour dépister les nouveaux inhibiteurs qui ont agi spécifiquement aux premiers stades de l’infection à VIH-1 jusqu’au point de fusion membranaire virale. Un défi à l’infection de cellule-cellule de mesure est que l’inoculum initial contienne des cellules du donneur contaminé et cible ininfected, mesure nouvelle infection est donc difficile de distinguer des cellules d’entrée. Le système idéal impliquerait un gène hétérologue marqueur qui peut être induit par l’ouverture d’une infection de cellule cible et n’est pas présent dans la cellule du donneur. Un contenu viral populaire mêlant analyse basée sur un mélange de protéines-enzyme virale, BlaM-Vpr, peut s’avérer efficace, mais a ses limites pour un débit élevé, cellules de dépistage2. Ce test implique un gène rapporteur de bêta-lactamase (BlaM) qui est fusionné à Vpr du VIH-1, empaqueté dans des virions et livré dans les cellules cibles sur la fusion membranaire virale. Le substrat CCF2-AM est chargé dans le cytoplasme des cellules cibles et subit un changement de fluorescence par clivage. Le substrat CCF2-AM est coûteux et peut être prohibitif pour les écrans de haut débit. Afin de distinguer les cellules de donneur et la cible, il est nécessaire de colorant-étiquette les populations ciblées. Enfin, le protocole nécessite plusieurs étapes de lavage et d’incubation qui peuvent être fastidieux et coûteux lorsque vous testez un grand nombre de composés.

Le dosage de Gag-iCre a été développé comme une solution à ces problèmes, à développer un dépistage des inhibiteurs de la fusion de cellule à cellule transmission haut débit. Ce système ne nécessite pas de substrat doit être chargé dans les cellules. Le test peut également être utilisé pour les études acellulaire et est adaptable à d’autres études de fusion virale utilisant des particules de virus VIH-1 Gag-iCre Pseudo-aléatoire typés. Fusion des essais VIH Env médiée par cellules peuvent de mesurer le fusion virus Env induite par la protéine cellulaire, mais ceux-ci n’utilisent pas de particules virales réelles comme le test de VIH-1 Gag-iCre3,4,5. Ce dosage peut être lu avec la microscopie écoulement cytometry ou de fluorescence. Il a été utilisé avec succès à l’écran de la bibliothèque de la FDA, mais aussi une petite bibliothèque de purinergiques inhibiteurs1,6. Autres chercheurs ont également identifié purinergiques inhibiteurs de fusion du VIH-1 à l’aide d’un test de fusion haut débit adaptée et optimisée qui signale le transfert de bêta-lactamase virus encapsulé dans le cytoplasme7,8 .

Le virus de Gag-iCre a été conçu avec une approche similaire au virus Gag-iGFP, insérant une recombinase Cre entre la matrice et de la capside, flanqué de HIV-1 protéase sites9. L’enzyme de la Cre est fait comme un précurseur inséré au sein de la polyprotéine Gag qui mûrit en activant la protéase du VIH-1 dans la particule virale naissante. La livraison de la Cre est donc tributaire de la livraison du contenu d’une particule de HIV-1 protéase activée dans une cible cellulaire via un processus de fusion des membranes virales. Deux versions du protocole sont fournies ici. Le premier utilise une population infectés par le VIH-1 pour infecter les cellules cibles, afin d’étudier la transmission directe de cellule à cellule du VIH. La deuxième version utilise un virus acellulaire pour étudier une virose acellulaire. Le test de cellule à cellule transmission prend 7 jours au complet de la journée, que les cellules sont décongelés, ou 5 jours si les cellules sont déjà décongelés et repiquées. Le test d’infection acellulaire peut être réalisé en 5 jours si les cellules doivent être décongelés et 3 jours si les cellules sont décongelés et repiquées. Instructions sont également fournies pour produire une lignée de cellules de cible (rouge-à-vert) RG dans le type de cellule désiré (si une lignée de cellules de cible RG préexistante n’est pas utilisée) à l’aide d’un plasmide, créé par le laboratoire Clevers10. Il est recommandé que mesures de biosécurité appropriées sont prises avec le virus et les cellules exprimant le virus dans ce test. Nous effectuons la partie infectieuse de ce test dans une installation de culture de tissus BSL2 +. Après que les cellules sont fixées, elles peuvent être analysées dans les installations de microscopie et cytométrie en flux standard.

Nous décrivons ici l’application de ce test à l’écran pour roman composés qui inhibent la fusion de la membrane virale du VIH-1 (Figure 1). Récepteurs purinergiques sont des médiateurs pro-inflammatoires. Notre laboratoire a démontré que les inhibiteurs non sélectifs des récepteurs purinergiques agissent comme inhibiteurs du VIH-1 membrane virale fusion6. Les auteurs rapportent que l’utilisation de ce test à un débit élevé peut identifier de nouveaux inhibiteurs de fusion membrane virale du VIH-1. Nous démontrons qu’un inhibiteur de classe des récepteurs purinergiques représente une nouvelle classe d’inhibiteurs de fusion membrane virale du VIH-1.

Protocol

1. génération de lignées de cellules de cible Remarque : Cette étape est facultative ; Si vous utilisez une ligne de cellule cible RG existante, commencez à l’étape 2. Cotransfect une plaque de confluentes 10 cm 70 % 293 t et cellules11 [dans 10 mL de milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % sérum fœtal (SVF)] avec pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE10 et pCL-10 a 112 (plasmide embal…

Representative Results

Les cellules Jurkat RG non infectées présentent un faible niveau de signal de fond GFP (0,3 %) avec un signal très fort de DP (Figure 2 a, colonne non infecté). L’infection avec Gag-iCre entraîne une augmentation du signal GFP (24,9 %), tandis que la présence de l’inhibiteur de fusion du VIH-1 AMD3100 (20 µM) inhibe le développement de ce signal, ramenant à des niveaux de fond non infectées (0,34 %). Quand un inhibiteur d’un événement post f…

Discussion

Le dosage de Gag-iCre s’est avéré pour être très utile pour le dépistage des candidats-médicaments qui peuvent inhiber l’étape de fusion de réplication virale. Lorsque vous effectuez ce test, les étapes les plus importantes pour obtenir un bon signal sont semblables à des essais d’infection virales plus. La première étape essentielle est la production des titres élevés de virus de bonne qualité. Cette étape nécessite que les cellules 293 t sont repiquées fréquemment (au moins 1 x tous les 48 h), …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par des subventions AI112423 NIH/NIAID et NIH/NIGM GM113885 à Benjamin K. Chen et NIH/NIAID K08-AI120806 à Talia H. Swartz. Nous tenons à remercier l’école de médecine de l’Icahn à du Mount Sinai doyen flow Cytometry CORE.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Sigma Aldrich D5546 Media for 293 Cells
RPMI-1640 Sigma Aldrich R0883 Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin Gibco 16140-071 Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.03 Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution GE Healthcare Life sciences SV30010 Penn/Strep used in both media
T75 Flasks Corning 3073 Used for Culture of Jurkat Cells
10cm Tissue Culture Plates Corning 430167 Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated) Corning 3595 Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent Signagen SL100688 Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537-100ML Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease GE Healthcare Life sciences SH30042.01 For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus GE Healthcare Life sciences 17144002 For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes Fisher Brand 13-678-11E For all tissue culture
Pipettor Tips Denville Scientific P3020-CPS For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 micron) Millipore SLHA033 For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes BD Diagnostics 309656 For filtration of virus
Amaxa Nucleofector Lonza 2b for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood Various models Fortessa 2
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Esposito, A. M., Soare, A. Y., Patel, F., Satija, N., Chen, B. K., Swartz, T. H. A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion. J. Vis. Exp. (138), e58074, doi:10.3791/58074 (2018).

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