אנו מתארים פרוטוקול לביצוע בתוך הרחם השתלת (דליה) דרך מסלולים תוך ורידי, אינטרה-שפיר של הזרקת במודל מאתר. פרוטוקול זה ניתן להציג תאים וקטורים ויראלי, חומרים אחרים לתוך לסביבה הייחודית של העובר החיסון-סובלנית.
השתלת בתוך הרחם (דליה) הוא מצב ייחודי ופסיביות של טיפול זה יכול לשמש כדי להציג את תאי גזע, וקטורים ויראלי או חומרים אחרים בשלב מוקדם ההיריון. הרציונל מאחורי דליה למטרות טיפוליות מבוססת על גודל קטן של העובר, חוסר בגרות אוטואימונית עוברית, נגישות הטבע שגשוג של תאי גזע או קדמון עוברית, ואת הפוטנציאל לטיפול במחלה או הופעת התסמינים לפני הלידה. ניצול של מאפיינים התפתחותיים רגילים אלה של העובר, המסירה של תאי גזע hematopoietic (HSC) דרך של דליה יש פוטנציאל לטיפול בהפרעות המטולוגיות מולדות כגון מחלה חרמשית, בלי הדרוש myeloablative או מיזוג לדיכוי המערכת החיסונית הדרושים עבור מועדון הכדורגל מונפלייה כמחנכת השתלת. באופן דומה, הנגישות של ובתאים באיברים רבים במהלך התפתחות פוטנציאל מאפשר מיקוד יעיל יותר של גזע/ובתאים בעקבות של דליה של וקטורים ויראלי ריפוי גנטי או גנום לעריכה. בנוסף, דליה יכול להיות המשמשות ללימוד תהליכים התפתחותיים נורמליים, לרבות, אך מבלי להגביל, הפיתוח של סובלנות אוטואימונית. המודל מאתר מספק אמצעים יקר ומשתלם כדי להבין את הפוטנציאל ואת המגבלות של דליה לפני ניסויים פרה-קליניים מחקרים שנעשו בבעלי חיים גדולים, יישום קליני בסופו של דבר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לביצוע של דליה העובר מאתר דרך מסלולים תוך ורידי, אינטרה-שפיר. פרוטוקול זה שימש בהצלחה התירי את התנאים הנדרשים ואת מנגנוני מאחורי בתוך הרחם השתלת תא גזע hematopoietic, סובלנות אינדוקציה, ריפוי גנטי בתוך הרחם .
התפתחויות אחרונות ההקרנה קדם-לידתית ואבחון הביאו כדי להאיר את האפשרות לטיפול העובר במשך מספר הפרעות מולדות אשר לא קיימות אפשרויות טיפול הולם כמחנכת ולגרום לזיהום משמעותי. באופן ספציפי, בתוך הרחם השתלת תא גזע hematopoietic (IUHCT) ועריכה טיפול/הגנום ג’ין יש את היכולת לנצל נורמלי מאפיינים התפתחותיים של העובר כדי לטפל מולדת המטולוגיות, המערכת החיסונית, גנטי והפרעות ביעילות רבה יותר מאשר השתלת HSC כמחנכת ועריכה טיפול/הגנום ג’ין יכול לעשות1,2. באופן ספציפי, בשל גודלו הקטן של העובר, התורם בתא או מינון וקטור ויראלי יכול להיות מוגדלים לפי המשקל של הנמען. בנוסף, מאפשרת חוסר בגרות אוטואימונית של העובר התורם HSCs כדי להיות מוזרק ללא myeloablative, לדיכוי המערכת החיסונית מיזוג זה נדרשת השתלת כמחנכת בפרוטוקולים. באופן דומה, וקטורים ויראלי נושאת transgene טיפולית או טכנולוגיה העריכה הגנום של יכול להיות מוזרק ללא לתגובה החיסונית המגביל את המוצר transgene או וקטור ויראלי. סוף סוף, הנגישות והטבע המקדימות של גזע עוברי/ובתאים לממן את האפשרות של התמרה חושית יעילה יותר של היעד ובתאים, וכן מסוימים מצבים של הגנום העריכה (מכוון הומולוגיה תיקון) הדורשים רכיבה על אופניים תאים כדי שתתבצע ביעילות. המודל מאתר משמש כאמצעי תובנה ובמחיר להפנות שאלות חשובות של ביולוגיית תאי הגזע ואימונולוגיה לפני ניסויים במודלים של בעלי חיים גדולים ניסויים פרה-קליניים, ככזה, שימש מאמצת את IUHCT, ברחם ריפוי גנטי כבר בחנו1,2,3.
למרות משתנים רבים לשחק תפקיד חשוב להצלחת IUHCT ועריכה בתוך הרחם ג’ין טיפול/הגנום במודלים של בעלי חיים מאתר וגדולים, משתנה מפתח היא שיטת מסירה של HSCs או וקטור ויראלי. המסירה של כמויות גדולות של התורם HSCs עם אפקט כניסה ראשונה המתרחשים בכבד העובר, האיבר hematopoietic בזמן IUHCT, הוכח להיות אינסטרומנטלי להשגת רמות macrochimeric engraftment עכבר, מודלים בעלי חיים גדולים4 ,5. הייתה זו מושגת באמצעות הזרקה של התורם התאים דרך הווריד vitelline במודל עכבר, באמצעות זריקה אינטרה-הלב במודל הכלביים. התוואי של הזרקת גם ממלא תפקיד מהותי המיקוד ובתאים של איברים שונים במהלך הפיתוח. לדוגמה, לעירוי הזרקה דרך הווריד vitelline של הוכח ביעילות מגלי cardiomyocytes, hepatocytes בעקבות בסוף ההיריון הזרקת6,7. לחלופין, זריקה אינטרה-שפיר של וקטורים ויראלי מאפשרת התמקדות האיברים החשופים פיזית המבוססת על עובריים הקיפול/פיתוח בזמנו של הזרקת8. דוגמה לכך הוא הטוב ביותר על ידי מיקוד של אפיתל בדרכי הנשימה באמצעות זריקה אינטרה-שפיר בסוף ההיריון לנצל נורמלי “נשימה” תנועות. עובריות, החושפת את מערכת הנשימה כדי וקטור ויראלי ב- מי השפיר נוזל9. שני מצבים אלה של דליה, תוך ורידי דרך הווריד של vitelline ו- “אינטרה”-מי השפיר, היו הבסיס לניסויים קודמים ומתמשכים מרובים במעבדה שלנו. ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט את השיטות לביצוע תוך ורידי, אינטרה-שפיר דליה במודל מאתר.
השתלת בתוך הרחם הוא טיפול פוטנציאלי עבור רבים הפרעות מולדות אשר יכול להיות מאובחנים בשלב מוקדם של ההיריון. המודל מאתר דליה מאפשר לחוקרים לחקור את הסביבה עוברית או להתנסות עם טיפולים שונים. תלוי מה להיות מוזרק, מה הוא על הכוונת, השתלת תוך ורידי או אינטרה-שפיר בתוך הרחם יכול לספק מש…
The authors have nothing to disclose.
Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
Tape | 3M | 1527-1 | |
Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
Heating Pad | K&H | 3060 | |
Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
Injector | Narishige | HI01PK01 | |
Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
Insulin Syringe | BD | 305935 | |
Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
N2 gas | Airgas | NI 125 | |
O2 gas | Airgas | OX 125 | |
Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |